عالية الدقة قياس التنفس لتقييم وظيفة الميتوكوندريا في Permeabilized وخلايا سليمة
Summary
يستخدم عالية الدقة قياس التنفس لتحديد استهلاك الأوكسجين الميتوكوندريا. هذا هو أسلوب واضحة لتحديد المجمعات السلسلة التنفسية الميتوكوندريا "(I-IV) وتيرة التنفس، أقصى قدرة الميتوكوندريا نظام نقل الإلكترون، والميتوكوندريا سلامة الغشاء الخارجي.
Abstract
A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in biological samples (intact and permeabilized cells, tissues or isolated mitochondria). The high-resolution oxygraph device is equipped with two chambers and uses polarographic oxygen sensors to measure oxygen concentration and calculate oxygen consumption within each chamber. Oxygen consumption rates are calculated using software and expressed as picomoles per second per number of cells. Each high-resolution oxygraph chamber contains a stopper with injection ports, which makes it ideal for substrate-uncoupler-inhibitor titrations or detergent titration protocols for determining effective and optimum concentrations for plasma membrane permeabilization. The technique can be applied to measure respiration in a wide range of cell types and also provides information on mitochondrial quality and integrity, and maximal mitochondrial respiratory electron transport system capacity.
Introduction
الميتوكوندريا الوفاء أدوارا هامة في التمثيل الغذائي للطاقة الخلوية، وخاصة باستخدام الأكسجين لإنتاج أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP). كانوا متورطين في موت الخلايا وفي العديد من الأمراض التي تصيب الإنسان. الفسفرة المؤكسدة الميتوكوندريا (OXPHOS) يجمع بين نقل الإلكترون على طول سلسلة نقل الإلكترون مع استهلاك الأكسجين والتوليف اعبي التنس المحترفين. وتشارك حمض (TCA) دورة الثلاثي الكربوكسيل الميتوكوندريا في تحويل البروتينات والكربوهيدرات والدهون إلى طاقة المركبات الغنية ثنائي النوكليوتيد نيكوتيناميد الأدينين (NADH) وفلافين ثنائي النوكليوتيد الأدينين (القوات المسلحة الهايتية 2). ثم يتم نقل الإلكترونات من NADH والقوات المسلحة الهايتية 2 إلى المجمعات بروتين سلسلة نقل الإلكترون التنفسية (من الأول إلى الرابع) الموجود في غشاء الميتوكوندريا الداخلية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن للمسارين الأكسدة الأخرى نقل الإلكترونات إلى إلكترون سلسلة النقل: ط) الميتوكوندريا الإلكترون نقل بروتين فلافيني (ETF) الذي يقع على وجه مصفوفة من ميتو الداخليغشاء chondrial، واللوازم الإلكترونات من الأحماض الدهنية β للأكسدة. والثاني) الميتوكوندريا سكرولي نازعة الذي يتأكسد سكرولي إلى فوسفات ثنائي هيدروكسي أسيتون ويغذي الإلكترونات إلى سلسلة نقل الإلكترون الميتوكوندريا. رابعا مجمع (المتقبلة الإلكترون النهائي) بنقل الإلكترونات إلى جزيء أكسجين واحدة، وتحويل الأوكسجين إلى جزيئين من الماء. ويقترن تتحرك الإلكترونات من الجهاز التنفسي مجمع سلسلة نقل الإلكترون من الأول إلى الرابع مع تدفق بروتون من المصفوفة الميتوكوندريا إلى الفضاء intermembrane التي تنص على التدرج الكهروكيميائي عبر الغشاء الداخلي الميتوكوندريا. بعد ذلك، الميتوكوندريا الخامس معقدة (ATP سينسيز) المكوكات أيونات الهيدروجين مرة أخرى إلى مصفوفة الميتوكوندريا ويجمع جزيئات ATP. ويمكن تقييم وظيفة OXPHOS في المجراة في المختبر باستخدام مختلف التقنيات ومختلف الدول التنفس الميتوكوندريا يمكن الحصول عليها. في الميتوكوندريا عزلة الجه التاليةيمكن للدول راي أن تقاس: ط) القاعدية التنفس الميتوكوندريا (الدولة 1)، والثاني) استهلاك الأوكسجين بعد إضافة ركائز محددة من المجمعات السلسلة التنفسية الميتوكوندريا (الدولة 2)، ج) أقصى استهلاك الأوكسجين الميتوكوندريا بعد إضافة تشبع تركيزات ثنائي فسفات الأدينوزين (ADP) (الدولة 3) و، والرابع) يستريح التنفس بعد استهلاك ADP (تحويلها إلى ATP) (الدولة 4). في خلايا سليمة يمكن قياس دول الجهاز التنفسي التالية: أ) القاعدية الخلوية استهلاك الأكسجين في وجود ركائز الداخلية وشرطة أبوظبي، والثاني) القاعدية الخلوية استهلاك الأكسجين في وجود أوليغوميسين (أوليغوميسين-حساس التنفس) وأوليغوميسين تراعي التنفس (ATP دوران)، الثالث) FCCP التنفس وفكت، والرابع) التنفس غير الميتوكوندريا بعد إضافة أنتيمايسين إيه وروتينون. في الخلايا permeabilized، ركائز محددة من المجمعات سلسلة نقل الإلكترون وADP يمكن إضافة والقصوى التي تعتمد على مجمع وتيرة التنفس الصورةاوك I- معقدة، ثانيا: ومعدلات التنفس IV-تعتمد يمكن قياسها.
قياسات التنفس الخلوي توفر نظرة ثاقبة قدرة الجهاز التنفسي الميتوكوندريا محددة لالمجمعات من الأول إلى الرابع، سلامة الميتوكوندريا والطاقة والتمثيل الغذائي 1، 2، 3. واحد من الأجهزة التي تتيح قياس استهلاك الأوكسجين الميتوكوندريا مع دقة عالية، قرار والحساسية هي عالية الدقة oxygraph 4. يحتوي الجهاز عالية الدقة oxygraph غرفتين مع منافذ الحقن وتم تجهيز كل غرفة مع جهاز استشعار الأكسجين البولاروجرافي. وأثار الخلوية أو معزولة تعليق الميتوكوندريا مستمر في مقياس التنفس. لتقييم وظيفة الميتوكوندريا، ركائز ومثبطات للنشاط معقد الميتوكوندريا يمكن أن تضاف التالية البروتوكولات القياسية. ركائز ومثبطات يمكن معاير التي كتبها الباحث حقنس مخادع oxygraph، ومعدلات استهلاك الأوكسجين وتحسب باستخدام البرمجيات ويعبر عنه picomoles في الثانية الواحدة في عدد من الخلايا. يقدم عالية الدقة قياس التنفس العديد من المزايا الأجهزة الكهربائي الأكسجين البولاروجرافي التقليدية والتقليدية بما في ذلك زيادة الحساسية والقدرة على العمل مع أعداد صغيرة من عينات بيولوجية مثل خلايا سليمة أو permeabilized. وبالإضافة إلى ذلك، كل جهاز يحتوي على غرفتين، ومعدلات التنفس يمكن تسجيلها في وقت واحد لمقارنة تركيزات الأكسجين. لديه عالية الدقة oxygraph أيضا ميزة تقليل تسرب الأوكسجين من غرف جهاز مقارنة بالأجهزة الأكسجين الكهربائي التقليدية البولاروجرافي. جهاز آخر وضعت مؤخرا لقياس استهلاك الأوكسجين الخلوية هو 96-جيدا محلل تدفق خارج الخلية 5. وقد تم تجهيز محلل تدفق خارج الخلية مع مضان بدلا من أجهزة الاستشعار البولاروجرافي. مزايا خارج الخليةلذا محلل تدفق مقارنة مع ذات الدقة العالية oxygraph هي ط) هو جهاز آلي إلى حد كبير، والثاني) أنه من الممكن لقياس استهلاك الأوكسجين في 24- ولوحات 96-جيدا لفحص الإنتاجية العالية، التي تتطلب كميات أقل من العينات البيولوجية، وج) قياس إضافية من تدفق حال السكر الخلوي هو ممكن. مساوئ محلل تدفق خارج الخلية بالمقارنة مع ذات الدقة العالية oxygraph هي ط) التكاليف العالية للجهاز والمواد الاستهلاكية مثل لوحات نيون، والتي هي غير قابلة لإعادة الاستخدام، والثاني) مركبات أربعة فقط في فحص / جيد هي غالبا عن طريق الحقن وبالتالي فإن هذا النظام لا يمكن لبروتوكولات المعايرة الركيزة uncoupler المانع.
في هذه الدراسة، ونحن نستخدم عالية الدقة قياس التنفس لتحديد التنفس الميتوكوندريا. للتجارب استهلاك الأوكسجين الخلوية، وpermeabilized الخلايا لتسمح بدخول ADP خارجي وركائز الميتوكوندريا أكسدة لتغذية الإلكترونات إلى المركبالصورة من الجهاز التنفسي. هذا النهج يسمح للتشريح من المجمعات الميتوكوندريا الفردية قدرات الجهاز التنفسي، والذي هو ميزة واضحة مقارنة مع خلايا سليمة (العديد من ركائز هي الخلية impermeant). ومع ذلك، فإن غشاء الخلية permeabilization تعطيل الحاجز بين العصارة الخلوية والفضاء خارج الخلية والمتوسطة (تغسل المواد المذابة عصاري خلوي) وتشكيل الفضاء داخل الخلايا ومعايرتها مع المتوسط خارج الخلية. واحدة من مساوئ الخلايا permeabilized على خلايا سليمة هو أن الغشاء الخارجي الميتوكوندريا يمكن أن تتلف إذا استخدمت كميات كبيرة من المنظفات خلال permeabilization الخلية. في خلايا سليمة، القاعدية، إلى جانب وفكت التنفس من خلايا سليمة يمكن قياسها. هذه طريقة تقييم استهلاك الأوكسجين من خلايا سليمة من دون إضافة ركائز الخارجية وشرطة أبوظبي، إعادة إنتاج وظيفة الجهاز التنفسي في خلية متكاملة، وكذلك توفير المعلومات عن الأقصى TRANSPO الإلكترون الميتوكوندرياالقدرة غ 6 و 7. واحدة من مزايا خلايا سليمة على الخلايا permeabilized هو أن البيئة الخلوية لا تتعطل والميتوكوندريا على اتصال مع مكونات كاملة من الخلايا. من أجل permeabilize غشاء البلازما الخلوي، وقد استخدمت المنظفات مثل ديجيتونين 8. ومع ذلك، الميتوكوندريا سلامة الغشاء الخارجي يمكن أن يتعرض للخطر إذا استخدمت كميات كبيرة من ديجيتونين. للتأكد من أن الميتوكوندريا سلامة الغشاء الخارجي عدم المساس في الخلايا permeabilized، يتم تنفيذ المعايرة ديجيتونين لتحديد تركيز الأمثل لpermeabilization الخلوي. لهذه التجارب، ومعلق الخلايا في المتوسط التنفس ومعاير تركيز ديجيتونين بواسطة قياس التنفس في وجود ركائز الميتوكوندريا وشرطة أبوظبي، ومعدلات التنفس وقياس. لا يتم تحفيز التنفس من خلايا سليمة وغير permeabilized بحضور mitochoركائز ndrial وشرطة أبوظبي. ومع ذلك، فإن اللاحقة المعايرة ديجيتونين تدريجي تسفر permeabilization التدريجي للأغشية البلازما، ويتم الحصول على التركيز ديجيتونين الأمثل. ويتضح ذلك من زيادة التنفس حتى permeabilization الكامل. جودة الميتوكوندريا وسلامة الغشاء الخارجي يمكن التحقق منها من خلال إضافة خارجية السيتوكروم ج 2، 9. السيتوكروم هو 12 كيلو دالتون الإلكترون البروتين الدفترية للالميتوكوندريا سلسلة نقل الإلكترون 10 و 11 و 12. يكون موضعيا في الفضاء intermembrane الميتوكوندريا، وتشارك في استهلاك الأوكسجين، ويحمل الإلكترونات من مجمع الثالث إلى الرابع معقدة. مرة واحدة تلف الغشاء الخارجي الميتوكوندريا، يتم تحريرها السيتوكروم ج، ويتم تقليل استهلاك الأوكسجين الميتوكوندريا. على إضافة الخارجية السيتوكروم ج، أي زيادة في التنفس الميتوكوندريا هو مؤشر علىتعطلت الغشاء الخارجي الميتوكوندريا.
في الخلايا permeabilized، ركائز ومثبطات النشاط المعقد الميتوكوندريا وأضاف التالية بروتوكولات مختلفة 3، 9. على سبيل المثال من أجل التحقيق في وتيرة التنفس الميتوكوندريا يحركها المجمع، وبروتوكول التالية يمكن استخدامها. بعد permeabilization من الخلايا، أولا أنا معقدة يتم تحفيز من قبل مالات ركائز والغلوتامات، التي تولد NADH باعتبارها الركيزة إلى السلسلة التنفسية واستفزاز تفعيل أولا تعقيدا بعد ذلك، يتم إضافة ADP لتحويلها إلى ATP (الدولة 3، نشط أنا التي تعتمد على مجمع التنفس). بعد الوصول إلى إشارة مستقرة، وتدار روتينون (مجمع الميتوكوندريا أنا المانع) لمنع أولا معقدة ويتبع روتنون التي كتبها السكسينات إلى القوات المسلحة الهايتية 2 وتفعيل مجمع الثاني (الدولة 3، ونشط مجمع التنفس II-التابعة). من أجل قياس معقدة التنفس التي تعتمد على الرابع، أول مجمع الثالثهو تحول دون التنفس معتمد على طريق إضافة أنتيمايسين إيه (الميتوكوندريا مجمع الثالث المانع). بعد ذلك، يتم تحفيز معقدة التنفس التي تعتمد على الرابع بالإدارة أسكوربات وtetramethylphenylendiamine (TMPD). TMPD يمكن لصناعة السيارات في أكسدة في المخزن المؤقت التنفس، وبالتالي يتم احتساب الأقصى معقدة معدل التنفس التي تعتمد على الرابع (الدولة 3) عن طريق طرح معدلات التنفس قبل وبعد إضافة أزيد الصوديوم، مثبط لالرابع معقدة الميتوكوندريا. ويمكن إجراء التجارب التنفس في غرفتين من oxygraph في مواز واحد بمثابة التحكم (الخلايا unstimulated)، وأخرى تحتوي على خلايا حفز. ومن الواضح أن الخلايا يمكن أن تكون مرحلة ما قبل المعاملة بطرق مختلفة، على سبيل المثال، مع العقاقير التي تؤثر على وظائف الميتوكوندريا، قبل أن يتم قياس استهلاك الأكسجين في الغرفة oxygraph. يسمح هذا البروتوكول الفحص الوظيفي للمجمعات السلسلة التنفسية الميتوكوندريا الفردية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن للمرء أن قياس ADP-حفز القصوىالتنفس (الدولة 3) من الخلايا permeabilized، وذلك باستخدام الأحماض الدهنية خارجي في شكل بالميتات. في هذا البروتوكول، ومترافق الأسهم تتركز بالميتات الصوديوم مع الأحماض الدهنية جدا البقري مجانا ألبومين المصل (BSA) (6: 1 المولي نسبة بالميتات: BSA). بعد ذلك، الخلايا أولا وpermeabilized مع التنفس ديجيتونين والميتوكوندريا يتم تقييمها من خلال إضافة الكارنيتين وبالميتات تليها إضافة ADP (الدولة 3، التنفس القصوى). ثم، يضاف أوليغوميسين لتقليد الدولة 4 (4O الدولة) ونسبة سيطرة الجهاز التنفسي (RCR قيمة) يتم احتساب كدولة 3 / دولة 4O. β للأكسدة تعزز إنتاج الاسيتيل جنة الزراعة (الذي يدخل في دورة TCA) والجيل القوات المسلحة الهايتية 2 و NADH، والإلكترونات التي تم تمريرها إلى سلسلة نقل الإلكترون من بروتين فلافيني-نقل الإلكترون وβ-هيدروكسي، لجنة الزراعة نازعة. الميتوكوندريا هي في مركز استقلاب الأحماض الدهنية وصفت بروتوكول بالميتات-BSA يمكن استخدامها من قبل الباحثين دراسة الدهونتاي أكسدة الأحماض. في خلايا سليمة، تضاف تفعيل ومثبطات النشاط المعقد الميتوكوندريا التالية بروتوكول آخر 6 و 9. لهذه التجارب، ويتم قياس استهلاك الأوكسجين الأول من خلايا غير permeabilized في غياب ركائز الخارجية (phosphorylating معدل التنفس). ثم، يتم قياس معدل التنفس غير phosphorylating بعد إضافة أوليغوميسين، الذي هو المانع من سينسيز ATP الميتوكوندريا. بعد ذلك، يتم إدارتها من protonophore الكربونيل السيانيد ف trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) بتركيزات مختلفة ويتم قياس معدل التنفس وفكت الميتوكوندريا القصوى. Protonophores مثل FCCP يمكن أن تحفز على زيادة في نفاذية بروتون من الغشاء الداخلي، والسماح حركة سلبية من البروتونات لتبديد التدرج التناضح الكيميائي. زيادة نفاذية بروتون uncouples التنفس الأكسدة (أي إنتاج ATP) ويستحث زيادة في ساستهلاك xygen. بعد ذلك، يتم إضافة روتينون وأنتيمايسين إيه لمنع التنفس الميتوكوندريا، ويتم طرح التنفس غير الميتوكوندريا من كل الأسعار الجهاز التنفسي الأخرى.
ويمكن التعبير عن معدلات استهلاك الأوكسجين كما IO 2 [بمول س ثانية -1 × 10 -6 الخلايا] (تدفق الأوكسجين في خلايا مليون) والذي يحسب بقسمة حجم معين تدفق الأكسجين (في غرفة الأوكسجين مغلقة)، JV، يا 2 [بمول س ثانية -1 س -1 مل] من تركيز خلية في غرفة الخلية (عدد الخلايا في حجم [10 6 خلايا ∙ مل 1]) 15. خلايا الشامل محدد تدفق الأكسجين، JO 2 [بمول س ثانية س -1 ملغ -1]، هو تدفق في الخلية، IO 2 [بمول س ثانية -1 × 10 -6 خلايا]، مقسوما على كتلة كل خلية [ملغ ∙ 10 6 خلايا]. أو حجم معين تدفق، JV، O 2 [بمول س ثانية -1 س -1 مل]، مقسوما على كتلة في المجلدأوميا [ملغ ∙ مل 1]. JO 2 هو تدفق الأكسجين في بروتين الخلية، الوزن الجاف أو حجم الخلية.
في هذه الدراسة باستخدام عالية الدقة قياس التنفس، نحن تصف بروتوكولات لتحديد ط) تركيز ديجيتونين الأمثل لكامل permeabilization الخلوي غشاء البلازما (ديجيتونين المعايرة فحص)، ب) الميتوكوندريا الخارجي سلامة غشاء باستخدام خارجية السيتوكروم ج، ج) الميتوكوندريا المجمعات السلسلة التنفسية أنا ومعدلات التنفس القصوى الثاني والرابع في الخلايا HepG2-permeabilized ديجيتونين في حضور ADP خارجي والميتوكوندريا ركائز السلسلة التنفسية، والرابع) القاعدية، إلى جانب والقصوى التنفس وفكت (أقصى طاقة النقل الإلكترون) من خلايا سليمة من دون إضافة ركائز الخارجية وADP، إعادة إنتاج وظيفة الجهاز التنفسي في خلية متكاملة.
Protocol
Representative Results
Discussion
وكان الهدف من هذا البروتوكول إلى استخدام عالية الدقة قياس التنفس لقياس المجمعات السلسلة التنفسية الميتوكوندريا "(I-IV) وتيرة التنفس، أقصى قدرة نظام نقل الإلكترون الميتوكوندريا والميتوكوندريا سلامة الغشاء الخارجي.
هناك بعض الخ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by the Swiss National Science Foundation (Grant nº 32003B_127619).
Materials
| ADP | Sigma | A 4386 | Chemical |
| Antimycin A | Sigma | A 8674 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Ascorbate | Merck | 1.00127 | Chemical |
| BSA | Sigma | A 6003 | Chemical |
| FCCP | Sigma | C 2920 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Countess automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | n/a | Automated cell counting instrument |
| Cytochrome c | Sigma | C 7752 | Chemical |
| Digitonin | Sigma | D 5628 | Chemical, dissolve in DMSO |
| DMEM | Gibco | 31966021 | Medium |
| EGTA | fluka | 3779 | Chemical |
| FBS | Gibco | 26010-074 | Medium component |
| Glutamate | Sigma, | G 1626 | Chemical |
| Hepes | Sigma | H 7523 | Chemical |
| KCl | Merck | 1.04936 | Chemical |
| KH2PO4 | Merck | 1.04873 | Chemical |
| K-lactobionate | Sigma | L 2398 | Chemical |
| MgCl2 | Sigma | M 9272 | Chemical |
| O2k-Core: Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | 10000-02 | High-resolution respirometry instrument |
| Oligomycin | Sigma | O 4876 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | Chemical |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | Chemical |
| Rotenone | Sigma | R 8875 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Succinate | Sigma | S 2378 | Chemical |
| Taurine | Sigma | T 8691 | Chemical |
| TMPD | Sigma | T 3134 | Chemical |
| Trypsin | Sigma | T 4674 | Chemical |
Referências
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem J. 435 (2), 297-312 (2011).
- Lanza, I. R., Nair, K. S. Functional assessment of isolated mitochondria in vitro. Methods Enzymol. 457, 349-372 (2009).
- Zhang, J., et al. Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells. Nat Protoc. 7 (6), 1068-1085 (2012).
- Gnaiger, E., Steinlechner-Maran, R., Mendez, G., Eberl, T., Margreiter, R. Control of mitochondrial and cellular respiration by oxygen. J Bioenerg Biomembr. 27 (6), 583-596 (1995).
- Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. Am J Physiol Cell Physiol. 292 (1), C125-C136 (2007).
- Djafarzadeh, S., Vuda, M., Takala, J., Jakob, S. M. Effect of remifentanil on mitochondrial oxygen consumption of cultured human hepatocytes. PLoS One. 7 (9), e45195 (2012).
- Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. Review: quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 67 (10), 1022-1035 (2012).
- Niklas, J., Melnyk, A., Yuan, Y., Heinzle, E. Selective permeabilization for the high-throughput measurement of compartmented enzyme activities in mammalian cells. Anal Biochem. 416 (2), 218-227 (2011).
- Jeger, V., et al. Dose response of endotoxin on hepatocyte and muscle mitochondrial respiration in vitro. Biomed Res Int. 2015, 353074 (2015).
- Nicholls, P. Cytochrome c binding to enzymes and membranes. Biochim Biophys Acta. 346 (3-4), 261-310 (1974).
- Cortese, J. D., Voglino, A. L., Hackenbrock, C. R. Multiple conformations of physiological membrane-bound cytochrome c. Bioquímica. 37 (18), 6402-6409 (1998).
- Gorbenko, G. P. Structure of cytochrome c complexes with phospholipids as revealed by resonance energy transfer. Biochim Biophys Acta. 1420 (1-2), 1-13 (1999).
- Gnaiger, E., Méndez, G., Hand, S. C. High phosphorylation efficiency and depression of uncoupled respiration in mitochondria under hypoxia. Proc Natl Acad Sci USA. 97, 11080-11085 (2000).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol Biol. 810, 25-58 (2012).
- Gnaiger, E. Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. An Introduction to OXPHOS Analysis. Mitochondr Physiol Network 17.18. , (2012).
