에서 미토콘드리아의 구조와 기능을 연구<em> 초파리</em> 난소
Summary
Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Specific methods for studying mitochondrial structure and function in live and fixed Drosophila ovaries are described and demonstrated in this paper.
Abstract
Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Fluorescence microscopy is an indispensable tool for the direct assessment of mitochondrial structure and function in live cells and for studying the mitochondrial structure-function relationship, which is primarily modulated by the molecules governing fission and fusion events between mitochondria. This paper describes and demonstrates specific methods for studying mitochondrial structure and function in live as well as in fixed tissue in the model organism Drosophila melanogaster. The tissue of choice here is the Drosophila ovary, which can be isolated and made amenable for ex vivo live confocal microscopy. Furthermore, the paper describes how to genetically manipulate the mitochondrial fission protein, Drp1, in Drosophila ovaries to study the involvement of Drp1-driven mitochondrial fission in modulating the mitochondrial structure-function relationship. The broad use of such methods is demonstrated in already-published as well as in novel data. The described methods can be further extended towards understanding the direct impact of nutrients and/or growth factors on the mitochondrial properties ex vivo. Given that mitochondrial dysregulation underlies the etiology of various diseases, the described innovative methods developed in a genetically tractable model organism, Drosophila, are anticipated to contribute significantly to the understanding of the mechanistic details of the mitochondrial structure-function relationship and to the development of mitochondria-directed therapeutic strategies.
Introduction
분화 된 세포들은 에너지 생산의 주요 시트이기 때문에 미토콘드리아 고전 셀룰러 최강으로 설명한다. 또한, 미토콘드리아 대사 발열 지질 변형, 칼슘 환원 항상성에 중요한 역할 셀 시그널링 프로세스 편성 등 일을 담당한다. 미토콘드리아는 활성 세포 사멸이 유도의 역할뿐만 아니라, 세포주기 조절 3을한다. 이러한 멀티 기능은 다음과 같은 근본적인 질문을 제기한다 : a) 방법 미토콘드리아 동시에 모든 기능을 수행하고 독특한 기능에 전문화되어 특정 미토콘드리아 풀 또는 서브 존의 b)가 무엇입니까? 이러한 맥락에서, 상기 다기능 미토콘드리아 개별 셀 내에서의 형상, 크기 및 구조를 동적 있음과 미토콘드리아의 정상 모양 세포 유형에 따라 다를 수 있음을 주목하는 것이 중요하다. 여러 실험실에서 연구의 수십 년oratories는 미토콘드리아의 모양, 크기, 구조, 총칭 미토콘드리아 역학의 변화는 다양한 미토콘드리아 기능 4,5,6을 유지하기위한 중요하는 것이 좋습니다. 이러한 연구 결과는 미토콘드리아가 구조적 역 동성 덕분에 자신의 멀티 기능을 수행 할 수있는 가능성을 올립니다.
광범위한 노력은 미토콘드리아의 구조 – 기능 관계를 이해하기 진행되고있다. 미토콘드리아 구조의 동력은 주로 서로 분열 및 융합 이벤트를 받아야하는 능력에 의해 유지된다. 두 개의 작은 미토콘드리아 사이의 융합이 큰 미토콘드리아 요소 (7)로 병합하는 동안 큰 미토콘드리아의 분열은 작은 미토콘드리아 요소로 변환합니다. 또한,이 미토콘드리아의 과도 융합은 그 내용의 혼합을 허용하도록 발생할 수 있습니다. 내부 및 외부 미토콘드리아 막의 분열 및 융합 이벤트는 조심스럽게 사양이 적용됩니다IFIC는 단백질로 설정합니다. 핵심 분열 기계는 Drp1 기능도에 의해 조절 될 수있는 반면, 어떤 선의의 미토콘드리아 단백질 (예를 들어, Fis1 또는 Mff1)과의 상호 작용에 의해 미토콘드리아에 세포질에서 모집한다 dynamin 관련 단백질 1 (Drp1)로 구성되어있다 미토콘드리아면 (4)에 다른 단백질. Drp1은 외막에서 작동되지만, 그 분열 능력뿐만 아니라 내막 영향을 미친다. 외부 및 내부 미토콘드리아 막의 분열의 오케스트레이션은 잘 이해되지 않습니다. mitofusins는 외부 막 (5)의 융합을 제어하면서 한편, 내막의 융합은 OPA1의 활동에 의해 코어에 적용된다. 미토콘드리아의 반작용 핵분열 융합 이벤트의 균형은 셀의 정상 미토콘드리아 형상을 지시. 예를 들어, 미토콘드리아 분열의 억압은 완전하고 반대가 융합 될 것이다 미토콘드리아의 이상 활동하면서리터의 분열은 미토콘드리아 3의 분열을 초래할 것입니다.
미토콘드리아 구조 – 기능 관계의 연구는 주로 무료 두 접근법을 포함한다 : a) 미토콘드리아 분열 / 융합 단백질의 유전자 조작 후에 세포 및 생명체의 표현형 분석 b) 미토콘드리아의 구조와 기능을 직접 평가. 이 표현형은 차 효과로 인해 발생할 수있는 유전 적 분석은 항상 (이 경우, 미토콘드리아 분열 / 융합 단백질)의 손에서 분자의 직접적인 기능을 표시하지 않을 수 있음은 주목할 만하다. 따라서, 개발 및 직접 미토콘드리아 구조 및 기능을 연구하기위한 도구를 사용하는 것은 아주 중요하다. 미토콘드리아 구조의 상관 평가 현미경 각종 도구를 포함한다. 미토콘드리아 동성이 양 성적 및 quantitat 모니터링 할 수 있기 때문에 생균의 형광 현미경의 사용은 크게 미토콘드리아 역학 연구를 진행했다적절한 형광 현미경 툴과 기술을 사용하여 8 ively. 형광 현미경 기반 도구 생체 9 미토콘드리아 동력의 중요성을 해명 라이브 고정 초파리 조직에서 미토콘드리아의 구조 및 기능을 연구하기 위해 개발되었다. 이들 및 관련 방법은 초파리의 난소에서 미토콘드리아의 구조와 기능을 연구 목표로, 여기에 설명되어 있습니다.
초파리의 난소는 germarium 10, 11에있는 각각의 성체 줄기 세포에서 발생하는 생식 세포와 체세포 계보로 구성되어 있습니다. 여섯 포체 배아 세포 GCS ()는 germarium (도 1)로부터 나오는 개별 계란 챔버를 형성하는 체세포 여포 세포 (FCS)에 의해 캡슐화 얻는다. 16 GC를 하나의 난자되고 커밋 얻고, 나머지 15은 GC를 난자 챔버의 성장을 지원 간호사 세포로 발달,이 마련되기 전에 난자의 성숙을 촉진. 그들은 말단 전방 여포 세포 (AFCS) 후방 여포 세포 (PFC를) 및 본체 세포 구성된 패터닝 상피 세포층으로 분화하는 유사 분열 세포주기를 종료하기 전에 FCS의 대부분은 유사 분열의 분할 9 원을 겪는다 (MBCS) . 연속 달걀 챔버는 초기 개발에서의 FC에서 파생 된 세포를 분화 줄기 세포에 의해 연결되어있다. 미토콘드리아 분열 단백질 Drp1 의해 조절 미토콘드리아 형상 적극적 초파리 난소 FC 층 9,12- 정상적인 발달 동안 분화 과정에 관여한다. 초파리 여포 세포층 개발 Drp1의 관련을 식별하기 위해이 연구에서 사용되는 방법이 여기에 설명된다.
Protocol
Representative Results
Discussion
프로토콜 내에서 중요한 단계
광표백 : 형광 샘플의 과도한 광표백을 방지하는 효율적인 공 초점 현미경을 수행에 절대적으로 필요하다. 따라서 접안 렌즈를 통해 샘플을 찾기 위해 또는 라이브 스캐닝 모드를 통해 영상 획득 파라미터를 설정하는 데 사용되는 시간은 광표백을 최소화하기 위해 최소화되어야한다.
조직 손상 : 미토콘?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We acknowledge Leena Patel and Diamond Woodard for helping in the Drosophila medium preparation and Dr. Igor Chesnokov for providing access to the camera-attached stereomicroscope.
Materials
| Grace's Media (Insect Dissecting Medium) | Fisher Scientific | 30611031-2 | |
| 41 Paraformaldehyde AQ | Electronic Microscopy Sciences | 50-259-99 | |
| Mitotracker Green (overall mitochondrial stain) | Life Technologies | m7514 | Reconstitute and Aliquot |
| Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate | Sigma Aldrich | 87917-25MG | Reconstitute and Aliquot |
| MitoSox (Mito-Ros stain) | Life Technologies | m36008 | Reconstitute and Aliquot |
| PolyLysine | MP Biomedicals | ICN15017625 | |
| Fly Vials | Fisher Scientific | AS-515 | |
| Fly Conicals | Fisher Scientific | AS-355 | |
| Fly Vial Flugs | Fisher Scientific | AS273 | |
| Fly Conical Flugs | Fisher Scientific | AS 277 | |
| Jazzmix Drosophila food (Drosophila food) | Fisher Scientific | AS153 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9647-50G | |
| Cyclin E Antibody (d-300) | Santa Cruz | sc- 33748 | |
| ATPB antibody [3D5] – Mitochondrial Marker | AbCam | ab14730 | |
| Cy3 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-165-146 | |
| Cy5 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-175-144 | |
| Hoechst | Fisher Scientific | H3570 | |
| VectaShield | Fisher Scientific | H100 | |
| Azer Scientific EverMark Select Microscope Slides | Fisher Scientific | 22-026-252 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mat Tek Corp Glass Bottom Mircrowell Dish | Fisher Scientific | P35G-0-14-C | |
| Active Dried Yeast | Fisher Scientific | ICN10140001 | |
| Confocal Microscope | Carl Zeiss | LSM 700 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Technologies | 11251-20 | |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Technologies | 26016-12 | |
| Minutien Pins | Fine Science Technologies | 26002-15 | |
| MYFP ( w[*]; P{w[+mC]=sqh-EYFP-Mito}3 ) | Bloomington Stock Center | 7194 | |
| Fly Pad | Fly stuff | 59-118 | |
| Blowgun | Fly stuff | 54-104 | |
| Blowgun needle | Flystuff | 54-119 | |
| Dissecting Microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 | |
| Analyses software | Carl Zeiss | Zen | |
| Analyses software | Open source | Image J | |
| Research Macro Zoom Microscope | Olympus | MVX10 | |
| QICAM Fast 1394 Cooled Digital Camera, 12-bit, Mono | QImaging | QIC-F-M-12-C | |
| QCapture Pro 5.1 | QImaging |
Referências
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