Het bestuderen van mitochondriale structuur en functie in<em> Drosophila</em> Eierstokken
Summary
Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Specific methods for studying mitochondrial structure and function in live and fixed Drosophila ovaries are described and demonstrated in this paper.
Abstract
Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Fluorescence microscopy is an indispensable tool for the direct assessment of mitochondrial structure and function in live cells and for studying the mitochondrial structure-function relationship, which is primarily modulated by the molecules governing fission and fusion events between mitochondria. This paper describes and demonstrates specific methods for studying mitochondrial structure and function in live as well as in fixed tissue in the model organism Drosophila melanogaster. The tissue of choice here is the Drosophila ovary, which can be isolated and made amenable for ex vivo live confocal microscopy. Furthermore, the paper describes how to genetically manipulate the mitochondrial fission protein, Drp1, in Drosophila ovaries to study the involvement of Drp1-driven mitochondrial fission in modulating the mitochondrial structure-function relationship. The broad use of such methods is demonstrated in already-published as well as in novel data. The described methods can be further extended towards understanding the direct impact of nutrients and/or growth factors on the mitochondrial properties ex vivo. Given that mitochondrial dysregulation underlies the etiology of various diseases, the described innovative methods developed in a genetically tractable model organism, Drosophila, are anticipated to contribute significantly to the understanding of the mechanistic details of the mitochondrial structure-function relationship and to the development of mitochondria-directed therapeutic strategies.
Introduction
Mitochondriën zijn klassiek beschreven als de cellulaire powerhouse, omdat zij de belangrijkste zetels van de energieproductie in gedifferentieerde cellen. Bovendien mitochondria spelen een cruciale rol in de stofwisseling, warmteontwikkeling, lipide modificatie, calcium en redox homeostase, de orkestratie van cell signaling processen, etc 1. Mitochondriën ook een actieve rol bij de inductie van celdood 2, evenals regulering van de celcyclus 3 spelen. Dergelijke multifunctionaliteit roept de volgende fundamentele vragen: a) hoe mitochondriën presteren al deze functies gelijktijdig en b) zijn er specifieke mitochondriale zwembaden of subzones die gespecialiseerd zijn voor verschillende functies? In dit verband is het belangrijk op te merken dat de multifunctionele mitochondriën dynamisch van vorm, afmeting en structuur die afzonderlijke cellen en dat de steady-state vorm mitochondriën variëren tussen celtypen. Tientallen jaren van onderzoek uit verschillende labretorica suggereren dat de wijziging van de mitochondriale vorm, grootte en structuur, collectief genoemd mitochondriale dynamiek, is cruciaal voor het handhaven van verschillende mitochondriale functies 4,5,6. Deze bevindingen opmerkingen de mogelijkheid mitochondriën hun multifunctionaliteit kan bereiken vanwege de structurele dynamiek.
Uitgebreide inspanningen worden gedaan om de mitochondriale structuur-functie relatie te begrijpen. De dynamiek van mitochondriale structuur wordt voornamelijk onderhouden door hun vermogen om splitsing en fusie gebeurtenissen ondergaan met elkaar. Splijting van grote mitochondria omzet in kleinere mitochondriale elementen, terwijl fusie tussen twee kleinere mitochondria ze over in een grotere mitochondriale element 7. Bovendien kan voorbijgaande fusie van twee mitochondria opkomen bij het mengen van de inhoud mogelijk. De splitsing en fusie gebeurtenissen van de binnenste en buitenste membranen worden zorgvuldig geregeld door specific sets van eiwitten. De kern splijting machine is samengesteld uit dynamin gerelateerd eiwit 1 (Drp1), die wordt gerekruteerd uit het cytosol naar de mitochondria van de interactie met bepaalde bonafide mitochondriale eiwitten (bijvoorbeeld Fis1 of Mff1), terwijl Drp1 functie ook kan worden geregeld andere eiwitten op het oppervlak mitochondriale 4. Hoewel Drp1 werkt op de buitenste membraan, de splitsing vaardigheden invloed hebben op de binnenste membraan ook. De orkestratie van de splitsing van de buitenste en binnenste mitochondriële membranen is niet goed begrepen. Anderzijds is fusie van het binnenste membraan beheerst de kern door de activiteiten van Opa1, terwijl mitofusins regelen de fusie van het buitenste membraan 5. Het saldo van het tegengaan van kernsplijting en kernfusie gebeurtenissen van mitochondria dicteren de steady-state mitochondriale vorm in een cel. Bijvoorbeeld, onderdrukking van mitochondriale splitsing leiden tot volledig en ongehinderd fusie, terwijl de overactiviteit van mitochondriënl splitsing zou leiden tot fragmentatie van mitochondria 3.
De studie van de mitochondriale structuur-functie relatie omvat voornamelijk twee elkaar aanvullende benaderingen: a) analyses van de cellulaire en organismaal fenotypes na genetische manipulatie van mitochondriale splitsing / fusie-eiwitten en b) directe beoordeling van mitochondriale structuur en functie. Het is opmerkelijk dat genetische analyses de directe werking van het molecuul op de hand (in dit geval mitochondriale splitsing / fusie-eiwitten) niet altijd kan blijken, aangezien de fenotypes kunnen worden veroorzaakt door secundaire effecten. Het is daarom van het grootste belang te ontwikkelen en te gebruiken hulpmiddelen om mitochondriale structuur en functie direct bestuderen. Elke beoordeling van de mitochondriale structuur omvat verschillende microscopie gereedschappen. Het gebruik van fluorescentie microscopie van levende cellen is sterk gevorderd de studies van mitochondriale dynamiek, omdat mitochondriale dynamiek kan worden gecontroleerd, zowel kwalitatief als quantitattend met de juiste fluorescentiemicroscopie en -technieken 8. Fluorescentie-microscopie instrumenten ontwikkeld om mitochondriale structuur en functie te bestuderen in levende en vaste Drosophila melanogaster weefsels ophelderen van het belang van mitochondriale dynamiek in vivo 9. Deze en verwante werkwijzen worden beschreven, met als doel het bestuderen mitochondriale structuur en functie in de Drosophila eierstok.
De Drosophila eierstok bestaat uit kiemlijn en somatische lijnen, die voortvloeien uit hun volwassen stamcellen die in de germarium 10,11 bevinden. Zestien syncytieel kiemcellen (GC) krijgen ingekapseld door somatische follikel cellen (FCS) aan individuele ei kamers die naar voren komen uit de germarium (figuur 1) te vormen. Eén van de 16 GC gecommit om een eicel te worden, en de resterende 15 GC ontwikkelen tot verpleegkundige cellen die de groei van de eicel kamerhouderVergemakkelijking van de rijping van de eicel voordat het wordt gelegd. De meerderheid van de FC's ondergaan 9 ronden van mitotische delingen voordat ze de mitotische celcyclus verlaten terminaal differentiëren in een patroon epitheliale cellaag bestaande uit anterior follikelcellen (AFCs), posterior follikelcellen (PFK's) en hoofdlichaam cellen (MBCS) . De opeenvolgende ei kamers zijn verbonden door steel cellen die gedifferentieerd cellen die ook zijn afgeleid van het FK vroeg in de ontwikkeling. Mitochondriale vorm gereguleerd door de mitochondriale kernsplijting eiwit Drp1 is actief betrokken bij het proces van differentiatie tijdens de normale ontwikkeling van de Drosophila eierstokkanker FC laag 9,12. De in deze studies de betrokkenheid van Drp1 in Drosophila follikel cellaag ontwikkeling identificeren werkwijzen worden hier beschreven.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritische stappen in het protocol
Photobleaching: Het voorkomen van onnodige fotobleken van TL-monsters absoluut noodzakelijk is om het uitvoeren van efficiënte confocale microscopie. Daarom moet de tijd gebruikt om monsters te lokaliseren door het oculair of beeldopname parameters via levende scanmodus worden geminimaliseerd om fotobleken te minimaliseren.
Weefselbeschadiging: Aangezien mitochondria worden beschouwd als de sensoren van c…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We acknowledge Leena Patel and Diamond Woodard for helping in the Drosophila medium preparation and Dr. Igor Chesnokov for providing access to the camera-attached stereomicroscope.
Materials
| Grace's Media (Insect Dissecting Medium) | Fisher Scientific | 30611031-2 | |
| 41 Paraformaldehyde AQ | Electronic Microscopy Sciences | 50-259-99 | |
| Mitotracker Green (overall mitochondrial stain) | Life Technologies | m7514 | Reconstitute and Aliquot |
| Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate | Sigma Aldrich | 87917-25MG | Reconstitute and Aliquot |
| MitoSox (Mito-Ros stain) | Life Technologies | m36008 | Reconstitute and Aliquot |
| PolyLysine | MP Biomedicals | ICN15017625 | |
| Fly Vials | Fisher Scientific | AS-515 | |
| Fly Conicals | Fisher Scientific | AS-355 | |
| Fly Vial Flugs | Fisher Scientific | AS273 | |
| Fly Conical Flugs | Fisher Scientific | AS 277 | |
| Jazzmix Drosophila food (Drosophila food) | Fisher Scientific | AS153 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9647-50G | |
| Cyclin E Antibody (d-300) | Santa Cruz | sc- 33748 | |
| ATPB antibody [3D5] – Mitochondrial Marker | AbCam | ab14730 | |
| Cy3 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-165-146 | |
| Cy5 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-175-144 | |
| Hoechst | Fisher Scientific | H3570 | |
| VectaShield | Fisher Scientific | H100 | |
| Azer Scientific EverMark Select Microscope Slides | Fisher Scientific | 22-026-252 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mat Tek Corp Glass Bottom Mircrowell Dish | Fisher Scientific | P35G-0-14-C | |
| Active Dried Yeast | Fisher Scientific | ICN10140001 | |
| Confocal Microscope | Carl Zeiss | LSM 700 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Technologies | 11251-20 | |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Technologies | 26016-12 | |
| Minutien Pins | Fine Science Technologies | 26002-15 | |
| MYFP ( w[*]; P{w[+mC]=sqh-EYFP-Mito}3 ) | Bloomington Stock Center | 7194 | |
| Fly Pad | Fly stuff | 59-118 | |
| Blowgun | Fly stuff | 54-104 | |
| Blowgun needle | Flystuff | 54-119 | |
| Dissecting Microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 | |
| Analyses software | Carl Zeiss | Zen | |
| Analyses software | Open source | Image J | |
| Research Macro Zoom Microscope | Olympus | MVX10 | |
| QICAM Fast 1394 Cooled Digital Camera, 12-bit, Mono | QImaging | QIC-F-M-12-C | |
| QCapture Pro 5.1 | QImaging |
Referências
- Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
- Youle, R. J., van der Bliek, A. M. Mitochondrial fission, fusion, and stress. Science. 337 (6098), 1062-1065 (2012).
- Mitra, K. Mitochondrial fission-fusion as an emerging key regulator of cell proliferation and differentiation. Bioessays. , (2013).
- Kageyama, Y., Zhang, Z., Sesaki, H. Mitochondrial division: molecular machinery and physiological functions. Curr Opin Cell Biol. 23 (4), 427-434 (2011).
- Chen, H., Chan, D. C. Physiological functions of mitochondrial fusion. Ann N Y Acad Sci. 1201, 21-25 (2010).
- Liesa, M., Shirihai, O. S. Mitochondrial dynamics in the regulation of nutrient utilization and energy expenditure. Cell Metab. 17 (4), 491-506 (2013).
- Hoppins, S. The regulation of mitochondrial dynamics. Curr Opin Cell Biol. 29, 46-52 (2014).
- Mitra, K., Lippincott-Schwartz, J. Chapter 4, Analysis of mitochondrial dynamics and functions using imaging approaches. Curr Protoc Cell Biol. Chapter. , 21-21 (2010).
- Mitra, K., Rikhy, R., Lilly, M., Lippincott-Schwartz, J. DRP1-dependent mitochondrial fission initiates follicle cell differentiation during Drosophila oogenesis. J Cell Biol. 197 (4), 487-497 (2012).
- Klusza, S., Deng, W. M. At the crossroads of differentiation and proliferation: precise control of cell-cycle changes by multiple signaling pathways in Drosophila follicle cells. Bioessays. 33 (2), 124-134 (2011).
- Sahai-Hernandez, P., Castanieto, A., Nystul, T. G. Drosophila models of epithelial stem cells and their niches. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1 (3), 447-457 (2012).
- Parker, D. J., et al. A new mitochondrial pool of cyclin E, regulated by Drp1, is linked to cell-density-dependent cell proliferation. J Cell Sci. 128 (22), 4171-4182 (2015).
- Mitra, K., Wunder, C., Roysam, B., Lin, G., Lippincott-Schwartz, J. A hyperfused mitochondrial state achieved at G1-S regulates cyclin E buildup and entry into S phase. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (29), 11960-11965 (2009).
- Shidara, Y., Hollenbeck, P. J. Defects in mitochondrial axonal transport and membrane potential without increased reactive oxygen species production in a Drosophila model of Friedreich ataxia. J Neurosci. 30 (34), 11369-11378 (2010).
- Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth. Free Radic Biol Med. 48 (8), 983-1001 (2010).
- Haack, T., Bergstralh, D. T., St Johnston, D. Damage to the Drosophila follicle cell epithelium produces "false clones" with apparent polarity phenotypes. Biol Open. 2 (12), 1313-1320 (2013).
- Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417 (1), 1-13 (2009).
- Mandal, S., Guptan, P., Owusu-Ansah, E., Banerjee, U. Mitochondrial regulation of cell cycle progression during development as revealed by the tenured mutation in Drosophila. Dev Cell. 9 (6), 843-854 (2005).
- Tipping, M., Perrimon, N. Drosophila as a model for context-dependent tumorigenesis. J Cell Physiol. 229 (1), 27-33 (2014).
- Herranz, H., Eichenlaub, T., Cohen, S. M. Cancer in Drosophila: Imaginal Discs as a Model for Epithelial Tumor Formation. Curr Top Dev Biol. 116, 181-199 (2016).
- Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol Rev. 63 (2), 411-436 (2011).
