تدعمه سقالة زرع الجزر في سادة الدهون البربخ من الفئران السكري
Summary
هذا البروتوكول يوضح الفئران العزلة جزيرة والبذر على سقالة ديسيلولاريزد. تم زرع الجزر التي تدعم سقالة في لوحة الدهون البربخ من ستريبتوزوتوسين (ستز) التي يسببها الفئران السكري. نجت الجزر في موقع الزرع وعكست حالة فرط سكر الدم.
Abstract
وقد ثبت سريريا زرع جزيرة لتكون فعالة في علاج مرض السكري من النوع 1. ومع ذلك، فإن استراتيجية زرع داخل الكبد الحالية قد تتسبب في ردود فعل الدم كلها حادة ويؤدي إلى سوء إنغرافتمنت جزيرة. هنا، ونحن الإبلاغ عن بروتوكول قوي لزرع الجزر في موقع زرع خارج الكبد – لوحة الدهون البربخ (إف) – في نموذج الفأر السكري. تم وصف بروتوكول لعزل وتنقية الجزر في الغلة العالية من الفئران C57BL / 6J، وكذلك طريقة زرع يؤديها البذر الجزر على سقالة ديسيلولاريزد (دسس) وزرعها في موقع إف في الفئران C57BL / 6J سينجينيك المقدمة السكري بواسطة ستريبتوزوتوسين. الكسب غير المشروع دسس يحتوي على 500 الجزر عكس حالة فرط سكر الدم في غضون 10 يوما، في حين أن الجزر الحرة دون دسس المطلوبة 30 يوما على الأقل. تم الحفاظ على نقص سكر الدم لمدة تصل إلى 3 أشهر حتى تم الكشف عن الكسب غير المشروع. في الختام، دسس تعزيز إنغرافتمنت من الجزر في tموقع خارج الكبد من إف، والتي يمكن بسهولة استرجاعها ويمكن أن توفر منصة استنساخه ومفيدة للتحقيق في المواد سقالة، فضلا عن غيرها من المعلمات زرع المطلوبة ل إنغرافتمنت جزيرة ناجحة.
Introduction
داء السكري من النوع 1 (T1D) هو اضطراب الغدد الصماء المناعي الذاتي الذي يتم طرد خلايا الجزيرة من الجهاز المناعي، مما يجعل المرضى يعتمدون على حقن الأنسولين الخارجي لحياتهم كلها. ويمثل بروتوكول ادمونتون معلما بارزا في الدراسات السريرية لزرع الجزر. تم غرس الجزر من خلال الوريد البابي وزرعها في موقع داخل الكبد 1 . ومع ذلك، اثنين من العقبات الرئيسية – مصادر غير كافية من الجزر المانحة والجزيرة إنغرافتمنت الفقراء – منع نجاح واسع من زرع جزيرة 2 . عادة، الجزر تحتاج إلى جمعها من ثلاثة المانحين الجاد لعكس حالة فرط سكر الدم من مريض واحد. وهذا يرجع إلى انخفاض العائد من إجراءات العزلة جزيرة وفقدان جزيرة بعد زرع. على وجه الخصوص، على الرغم من أن ما بعد الزرع الجزر استحم في الدم الغنية بالأكسجين، والاتصال المباشر مع الدم في كثير من الأحيان أثارت لحظة اللثة بوساطة الدم(إبير)، والتي يمكن أن تسبب فقدان حاد في الجزر. على المدى الطويل، ويعتقد أن الخسارة التدريجية للجزر في المرضى تمثل انخفاض معدلات داء السكري في المجموعات السريرية، والتي يمكن أن تصل إلى 90٪ في السنة الأولى وانخفضت إلى 30٪ و 10٪ بنسبة 2 و 5 سنوات بعد الزرع، على التوالي 3 .
كان زرع جزيرة في مواقع خارج الكبد استراتيجية جذابة للحد من اتصال مباشر من الجزر مع الدم في حين حصر عمليات زرع إلى مواقع أكثر تحديدا مقارنة مع التسريب داخل الكبد. وقد أجريت دراسات في كبسولة الكلى والعين والعضلات، وسادات الدهون، والمساحات تحت الجلد على مدى السنوات الماضية، والتي تبين أن الجزر في هذه المواقع هي قادرة على البقاء على قيد الحياة وظيفة لاستعادة نورموجليسيميا 4 . وبالإضافة إلى ذلك، الجزر في هذه المواقع يمكن استرجاعها، مما يجعل من الممكن خزعة أو حتى لمزيد من إجراءات الاستبدال. خارج الكبد sوبالتالي فإنه يدل على إمكانات كبيرة للزرع السريري 5 .
وقد تم التحقيق بشكل مكثف السقالات القائمة على المواد البيولوجية لزرع الخلايا وهندسة الأنسجة. وعادة ما تحتوي السقالات ثلاثية الأبعاد (3D) على هياكل مسامية ويمكن أن تستخدم كقوالب خلوية لتوليد الهيكل المكاني / تنظيم الخلايا أو كخزانات لتوفير الإطلاق الخاضع للرقابة للإشارات النشطة بيولوجيا. كما تم ملفقة السقالات من المواد البوليمرية، مثل بولي (جليكوليد L- لاكتيد) 6 ، بولي (ديميثيلزيلوكسان) 7 ، والبولي بالحرارة (يوريتان) 8 ، لزرع الجزر في إف. بالمقارنة مع زرع الجزر مباشرة، تم العثور على استخدام السقالات للحد من فقدان جزيرة عن طريق منع تسرب الجزر في تجويف داخل الصفاق 9 ، 10 ، وتوفير الحماية الميكانيكية ومودوواللاتينغ رد فعل التهابات المحلي. وبالتالي يمكن تطوير السقالات لتعزيز جزيرة إنغرافتمنت في مواقع زرع 7 .
في هذه الدراسة، ونحن نعتزم إظهار نموذج زرع جزيرة في إف، التي أجريت في نماذج الفئران باستخدام دسس. وقد جذبت السقالات المستمدة من المصفوفات خارج الخلية اهتماما كبيرا في السنوات الأخيرة بسبب التوافق مع متفوقة والهياكل التي يسهل اختراقها أكثر طبيعية مقارنة مع المنتجات الاصطناعية. هنا، نحن تصف بروتوكول عزل قوي للحصول على الجزر البنكرياس في عوائد عالية من الفئران C57BL / 6J. ثم تم فرز دسس معالجتها من التامور البقري مع الجزر، وتم زرع الطعوم إلى إف في نماذج السكري متجانسة. تم تحقيق نقص السكر في الدم في الفئران في غضون 10 أيام، وتم الحفاظ عليه لمدة تصل إلى 100 يوما، حتى إزالة الطعوم.
Protocol
Representative Results
Discussion
البنكرياس نضح والهضم الوقت هما البارامترات الرئيسية التي تؤثر على العائد جزيرة والجودة. ذكرت موسكالوسكي أولا استخدام خليط كولاجيناز الخام لهضم المفروم غينيا بنكرياس خنزير 11 . لاسي وآخرون. وذكرت حقن الانزيمات في نظام القناة لإرضاء البنكرياس، مما أ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المؤلفين أود أن أشكر وي تشانغ من غوانهاو التكنولوجيا الحيوية لتوفير السقالات ديسلولاريزد. نشكر شياو هونغ بنغ للمناقشات مفيدة. وقد دعم هذا البحث ماليا من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (مشروع رقم 31322021).
Materials
| Dissecting scissor | Ningbo Medical | ||
| Forceps | Ningbo Medical | ||
| 0.5 mm diameter wire mesh | Ningbo Medical | ||
| 70 μm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Artery hemostatic clamp | Ningbo Medical | ||
| Microscopic hemostatic clamp | Ningbo Medical | ||
| Hemostatic forceps | Ningbo Medical | ||
| Absorbable 6-0 PGLA sutures | JINHUAN | With needle | |
| Wound clip | Ningbo Medical | ||
| Cotton swab | Ningbo Medical | ||
| Gauze | Ningbo Medical | ||
| Sterile drapes | Ningbo Medical | ||
| 10mL syringe | JINGHUAN | ||
| 1 mL syringe | JINGHUAN | ||
| 27G intravenous needle | JINGHUAN | 0.45×15 RWSB | |
| 1.5 mL Eppendorf tube | Axygen | ||
| 15mL conical tube | Corning | 430791 | |
| 50mL conical tube | Corning | 430829 | |
| 35mm Non-treated Peri-dishes | Corning | 430588 | |
| Transwell | Corning | 3422 | |
| 0.22 μm filter | Pall | PN4612 | |
| 10 mL serological pipet | Corning | 4488 | |
| Pipet filler S1 | Thermo Scientific | 9501 | |
| Pipette (2-20μL) | Axygen | AP-20 | AXYPETTM |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ61 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Hank’s balanced salt solution | Gibco | C14175500CP | |
| Collagenase P | Roche | COLLP-RO | |
| Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11879-20 | |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| D-glucose | Gibco | A24940-01 | |
| Glucose meter | Roche | ACCU-CHEK | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Streptozotocin | Sigma | V900890 | VetecTM |
| Chloral hydrate | J&K | C0073 | |
| Sodium citrate | Sigma | 71497 | |
| Citric acid | Sigma | C2404 | |
| Iodophors | Ningbo Medical | ||
| C57BL/6J, 10-12 weeks old | VitalRiver | Beijing, China | |
| Decellularized scaffold | Guanhao Biotec | 131102 | Guangzhou, China |
Referências
- Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).
- Shapiro, A. M. J., et al. International Trial of the Edmonton Protocol for Islet Transplantation. N Engl J Med. 355, 1318-1330 (2006).
- Ryan, E. A., et al. Five-year follow-up after clinical islet transplantation. Diabetes. 54, 2060-2069 (2005).
- Merani, S., Toso, C., Emamaullee, J., Shapiro, A. M. Optimal implantation site for pancreatic islet transplantation. Br J Surg. 95, 1449-1461 (2008).
- Schmidt, C. Pancreatic islets find a new transplant home in the omentum. Nat Biotechnol. 35 (1), (2017).
- Dufour, J. M., et al. Development of an ectopic site for islet transplantation, using biodegradable scaffolds. Tissue Eng. 11, 1323-1331 (2005).
- Weaver, J. D., et al. Controlled Release of Dexamethasone from Organosilicone Constructs for Local Modulation of Inflammation in Islet Transplantation. Tissue Eng Part A. 21, 2250-2261 (2015).
- Wang, K., et al. From Micro to Macro: The Hierarchical Design in a Micropatterned Scaffold for Cell Assembling and Transplantation. Adv Mater. 29, (2017).
- Blomeier, H., et al. Polymer Scaffolds as Synthetic Microenvironments for Extrahepatic Islet Transplantation. Transplantation. 82, 452-459 (2006).
- Gibly, R. F., et al. Extrahepatic islet transplantation with microporous polymer scaffolds in syngeneic mouse and allogeneic porcine models. Biomaterials. 32, 9677-9684 (2011).
- Moskalewski, S. Isolation and Culture of the Islets of Langerhans of the Guinea Pig. Gen Comp Endocrinol. 5, 342-353 (1965).
- Lacy, P. E., Kostianovsky, M. Method for the isolation of intact islets of Langerhans from the rat pancreas. Diabetes. 16, 35-39 (1967).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation. J Vis Exp. (50), (2011).
- Li, D. S., Yuan, Y. H., Tu, H. J., Liang, Q. L., Dai, L. J. A protocol for islet isolation from mouse pancreas. Nat Protoc. 4, 1649-1652 (2009).
- Stull, N. D., Breite, A., McCarthy, R., Tersey, S. A., Mirmira, R. G. Mouse Islet of Langerhans Isolation using a Combination of Purified Collagenase and Neutral Protease. J Vis Exp. (67), (2012).
- Sakata, N., Yoshimatsu, G., Tsuchiya, H., Egawa, S., Unno, M. Animal models of diabetes mellitus for islet transplantation. Exp Diabetes Res. , 256707 (2012).
- Schmidt, C. Pancreatic islets find a new transplant home in the omentum. Nat Biotech. 35, 8-8 (2017).
- Londono, R., Badylak, S. F. Biologic scaffolds for regenerative medicine: mechanisms of in vivo remodeling. Ann Biomed Eng. 43, 577-592 (2015).
