Stillasstøttet transplantasjon av øyer i epididymisk fettpute av diabetiske mus

Summary

Denne protokollen demonstrerer isolering av murin øl og såing på en decellularisert stillas. Stillasstøttede øyer ble transplantert i den epididymale fettpute av streptozotocin (STZ) -inducerte diabetiske mus. Islets overlevde på transplantasjonsstedet og reverserte den hyperglykemiske tilstanden.

Abstract

Isletransplantasjon har blitt klinisk bevist å være effektiv ved behandling av type 1 diabetes. Imidlertid kan den nåværende intrahepatiske transplantasjonsstrategien medføre akutte helblodsreaksjoner og resultere i dårlig øyelegging. Her rapporterer vi en robust protokoll for transplantasjon av øyer på det ekstrahepatiske transplantasjonsstedet – den epididymale fettputen (EFP) – i en diabetisk musemodell. En protokoll for isolering og rensing av øyer med høye utbytter fra C57BL / 6J-mus er beskrevet, så vel som en transplantasjonsmetode utført ved seeding-øyer på en decellularisert stillas (DCS) og implanterer dem på EFP-stedet i syngene C57BL / 6J mus-gjengede diabetiker Av streptozotocin. DCS-transplantatet som inneholdt 500 øyer reverserte den hyperglykemiske tilstanden innen 10 dager, mens de frie øyene uten DCS krevde minst 30 dager. Normoglykemi ble opprettholdt i opptil 3 måneder til graftet ble eksplantert. I konklusjonen økte DCS engraftment of islets into tHan ekstrahepatiske nettsted av EFP, som lett kunne hentes, og kan gi en reproduserbar og nyttig plattform for å undersøke stillasmaterialene, samt andre transplantasjonsparametere som kreves for en vellykket holning.

Introduction

Type 1 diabetes mellitus (T1D) er en autoimmun endokrin lidelse der øketsceller ablateres av immunsystemet, noe som gjør at pasientene er avhengige av injeksjon av eksogent insulin for hele livet. Edmonton-protokollen representerer en milepæl i kliniske studier av øletransplantasjon; Øyer ble infundert gjennom portalvenen og transplantert på det intrahepatiske område ¹ . Imidlertid hindrer to hovedhinder – utilstrekkelige kilder til donorøyler og fattig øyekraft – den store suksessen til øletransplantasjonen ² . Vanligvis må øyer samles fra tre cadaveric donorer for å reversere den hyperglykemiske tilstanden til en pasient; Dette skyldes det lave utbyttet av isolasjonsprosedyrer og øktapet etter transplantasjon. Spesielt, selv om post-transplantasjonsøyene ble badet i oksygenrikt blod, fremkalte direkte kontakt med blod ofte det øyeblikkelige blodmedierte inflammaTory reaksjon (IBMIR), som kan forårsake akutt tap av øyene. På lang sikt er det antatt at gradvis tap av øyer hos pasienter sto for nedgang i diabetesomslag i de kliniske gruppene, som kunne nå 90% i det første året og falt til 30% og 10% med 2 og 5 År etter transplantasjon, henholdsvis ³ .

Isletransplantasjon på ekstrahepatiske steder har vært en attraktiv strategi for å redusere direkte kontakt med øyer med blod mens de begrenser transplantasjonene til mer definerbare steder sammenlignet med intrahepatisk infusjon. Studier har blitt utført i nyrekapsel, øye, muskler, fettputer og subkutane rom de siste årene, og viser at øyer på disse områdene er i stand til å overleve og fungere for å gjenopprette normoglykemi ⁴ . I tillegg er øyene på disse områdene gjenvinnbare, noe som gjør det mulig for biopsi eller til og med for ytterligere utskiftingsprosedyrer. Ekstrahepatisk sDet viser derfor stort potensial for klinisk transplantasjon ⁵ .

Biomaterialbaserte stillaser har blitt intensivt undersøkt for celletransplantasjon og vevsteknikk. Tredimensjonale (3D) stillas inneholder vanligvis porøse strukturer og kan tjene som mobilmaler for å generere romlig struktur / organisering av celler eller som reservoarer for å gi kontrollert frigivelse av bioaktive signaler. Stillaser har også blitt fremstilt fra polymere materialer, slik som poly (glykolid-L-laktid) ⁶ , poly (dimetylsiloksan) ⁷ og termoplastisk poly (uretan) ⁸ , til transplantasjonsøyer i EFP. Sammenlignet med direkte transplantasjon av øyer ble bruken av stillas funnet å redusere øktapet ved å forhindre lekkasje av øyer i det intraperitoneale hulrom ^{9 , 10} , som gir mekanisk beskyttelse og moduLating den lokale inflammatoriske reaksjonen. Stillasene kan således bli utviklet for å fremme islet-inngrep på transplantasjonsstedene ⁷ .

I denne studien har vi tenkt å demonstrere et paradigme for øktransplantasjon i EFP, utført i musmodeller ved hjelp av en DCS. Stillaser avledet fra ekstracellulære matriser har tiltrukket stor interesse de siste årene på grunn av den overlegne biokompatibiliteten og mer naturlige porøse strukturer sammenlignet med syntetiske produkter. Her beskriver vi en robust isolasjonsprotokoll for å oppnå pankreasøyler med høye utbytter fra C57BL / 6J-mus. DCSer behandlet fra bovin perikardiet ble deretter sådd med øyer, og transplantatene ble transplantert til EFP i syngene diabetiske modeller. Normoglykemi hos mus ble oppnådd innen 10 dager og ble opprettholdt i opptil 100 dager, til fjerning av transplantatene.

Protocol

Alle eksperimenter ble godkjent av Peking University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC, IACUC nr. COE-LuoY-1). 1. Islet Isolation Fremstilling av reagenser og utstyr. Rekonstituer kollagenase P-pulver (2 U / mg) i HBSS for å lage en 5 mg / ml løsning og filtrer den gjennom et 0,22 μm filter for å fjerne bakteriene. Tilbered 0,6 ml alikvotoppløsninger av kollagenase P i 15 ml koniske rør og lagre ved -20 ° C. MERK: Under bruk…

Representative Results

Vår klemmetode, utført ved hjelp av en mikroskopisk hemostatisk klemme, er rett og tidsbesparende sammenlignet med suturligasjonsteknikken. Det tok omtrent 4 timer å isolere og rense ca. 1200 øyer fra 6 mus. De ferske isolerte øyene hadde typisk en grov periferi under et optisk mikroskop ( figur 3A ). Når øyene ble gjenopprettet fra isolasjonsprosessen, så de seg lyse og tette og kjøpte en jevn overflate. Imidlertid kan den stressende isolasjonen fr…

Discussion

Pancreas perfusjon og fordøyelsestid er to viktige parametere som påvirker øktutbytte og kvalitet. Moskalewski rapporterte først bruken av en rå kollagenaseblanding for å fordøye hakket marsvinpankreas ¹¹ . Lacy et al. Rapporterte injeksjonen av enzymer i kanalsystemet for å perfeksere bukspyttkjertelen, noe som økte økningen ^{12 i stor grad} . Den duale perfusjonen av enzym muliggjør maksimal eksponering av bukspyttkjertelenes overflateareal til enzymet,…

Materials

Dissecting scissor	Ningbo Medical
Forceps	Ningbo Medical
0.5 mm diameter wire mesh	Ningbo Medical
70 μm cell strainer	Falcon	352350
Artery hemostatic clamp	Ningbo Medical
Microscopic hemostatic clamp	Ningbo Medical
Hemostatic forceps	Ningbo Medical
Absorbable 6-0 PGLA sutures	JINHUAN		With needle
Wound clip	Ningbo Medical
Cotton swab	Ningbo Medical
Gauze	Ningbo Medical
Sterile drapes	Ningbo Medical
10mL syringe	JINGHUAN
1 mL syringe	JINGHUAN
27G intravenous needle	JINGHUAN	0.45×15 RWSB
1.5 mL Eppendorf tube	Axygen
15mL conical tube	Corning	430791
50mL conical tube	Corning	430829
35mm Non-treated  Peri-dishes	Corning	430588
Transwell	Corning	3422
0.22 μm filter	Pall	PN4612
10 mL serological pipet	Corning	4488
Pipet filler S1	Thermo Scientific	9501
Pipette (2-20μL)	Axygen	AP-20	AXYPETTM
Dissecting microscope	Olympus	SZ61
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Hank’s balanced salt solution	Gibco	C14175500CP
Collagenase P	Roche	COLLP-RO
Histopaque 1077	Sigma	10771
RPMI 1640	Gibco	11879-20
FBS	Gibco	16000-044
D-glucose	Gibco	A24940-01
Glucose meter	Roche		ACCU-CHEK
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140-122
Streptozotocin	Sigma	V900890	VetecTM
Chloral hydrate	J&K	C0073
Sodium citrate	Sigma	71497
Citric acid	Sigma	C2404
Iodophors	Ningbo Medical
C57BL/6J, 10-12 weeks old	VitalRiver		Beijing, China
Decellularized scaffold	Guanhao Biotec	131102	Guangzhou, China