在腹部实体器官移植中, 胰腺移植容易发生严重的缺血再灌注损伤-相关的移植损伤, 最终导致早期的移植丢失。该协议描述了一个模型的小鼠胰腺移植使用 non-suture 袖技术, 最适合于分析这些早期的, 有害的损害。
小鼠模型在移植研究中有几个优点, 包括易于处理, 各种基因定义的菌株, 以及最广泛的分子探针和试剂的可用性来执行体内以及体外研究。根据我们在各种小鼠移植模型中的经验, 我们开发了一种模型, 目的是分析严重缺血再灌注损伤相关的早期移植损伤的机制。与以前描述的技术使用缝合技术对比, 这里我们描述一个新的过程使用 non-suture 袖口技术。
近年来, 我们在小鼠胰腺移植术中进行了超过300例, 总体成功率为 > 90%, 在小老鼠胰腺中从未被描述成功。这种 non-suture 袖技术的骨干移植血管重建包括两个主要步骤: (I) 拉动接收器在聚乙烯/聚酰胺袖口和固定它与圆周结扎, 和 (II) 放置在捐助船只外翻接受者的船只, 并修复它与第二次圆周结扎。血管内皮层的连续性导致了血栓病变, 且通畅率高, 成功率高。
在这个模型中, 动脉吻合是通过拉动供体移植的腹主动脉在受体动物的外翻颈总动脉。静脉引流的移植是通过拉动门静脉移植的外翻外颈静脉的受体。这份手稿提供了器官恢复和器官植入程序的细节和关键步骤, 这将使研究人员有显微外科技术, 成功地在他们的实验室进行移植。
同时肾-胰移植 (SPK) 代表了目前的护理标准, 糖尿病患者和终末期肾脏疾病。成功的移植导致长期胰岛素独立与稳定甚至回归糖尿病血管和更好的生活质量1。然而, 与其他常见的实体器官移植, 如肾脏和肝移植, 胰腺移植更容易发生缺血再灌注损伤 (IRI)。报告的发病率高达 35%, 不仅危害移植, 甚至病人, 生存2,3。
氧化应激, 微循环紊乱, 炎细胞因子的表达增加, 黏附分子最终导致内皮细胞的活化和完整性丧失, 都归因于这种 non-allogeneic 移植损伤4. 到目前为止, IRI 的确切分子机制在很大程度上是未知的, 并且可能因器官而异。
尽管在利用体外模型方面取得了重大进展, 但动物模型的发展对于加深对在胰腺移植后的 IRI 相关的移植改变的分子机制的认识至关重要。几个胰腺移植模型已开发的啮齿动物5,6, 但只有一个报告在老鼠7。这种高度苛刻的显微外科手术的致命弱点是低存活率为46%。然而, 老鼠模型代表最佳的模型为移植相关的研究, 因为最广泛的各种各样的分子分析工具可以适用于他们。基于对不同器官移植小鼠的广泛显微外科经验8,9,10, 我们开发了一种新的, 高重复性的异位, 宫颈胰腺的技术用 non-suture 袖技术移植小鼠和 #62; 90% 成功率。与此技术, 吻合相关的并发症减少到最低, 并取得了很高的成功率, 可以实现与缝合模型11。到目前为止, 只有一个类似成功率的鼠标模型被刘et al12描述。然而, 目前还没有使用该模型发表的研究报告。
联合移植损伤是实体器官移植的固有功能, 其特点是微循环障碍。缺血期多代谢物的积累, 主要由活性氧和氮类介导的炎症叶栅的形成, 导致移植再灌注过程中的组织损伤4。这种级联不仅会危害短期, 而且会影响长期的成功, 从而对患者的生存有很大的作用14。到目前为止, 联合肾胰移植代表的选择治疗1型糖尿病与终末期肾脏疾病的病人15。一些研究表明, 成功的联合肾胰移植不仅能恢复和保护糖尿病患者的肾移植功能, 而且还能稳定甚至逆转继发性并发症, 包括神经病变以及微-和病变16,17,18。
尽管在动物研究中不断地减少、替换和提炼 (3 R), 但像 IRI 这样的复杂病理生理过程的复制在体外设置中是不可能的。因此, 动物模型仍然被认为是转化研究的理想工具19,20。与老鼠或其他动物模型相比, 这里描述的老鼠模型有几个优点。这些因素包括大量的基因定义的近交系小鼠菌株 (如转基因和淘汰赛菌株), 大量的分子分析工具, 以及一个简单和便宜的处理21。所述模型的主要优点在于 non-suture 袖套技术。通过使用本文提出的技术, 成功率和 #62; 90% 是可以实现的, 这比以前描述的模型22的效果要好得多。使用这种 non-suture 技术, 我们明显减少常见的并发症, 如休克休克, 血栓形成, 和狭窄的吻合12。这种方法的一个进一步的好处是包括额外的腹部位置的移植, 这是与快速术后恢复的接受者。此外, 宫颈位置使它完全适合体内分析, 如 exterioration 的活体成像, 无任何张力22。
该模型的主要缺点是阻断胰管, 这不像临床现实。在这个模型中, 外分泌引流是通过结扎胆胰管来管理的。从长期来看, 这导致了明显的纤维化和腺体萎缩, 而不导致移植性胰腺炎22。由于外分泌组织的这种恶化, 我们在移植后的30天早观察到, 我们认为这个模型不适合长期观察。与此相反, 未受损伤的内分泌功能使 gylcemic 控制接收器的一个简单的工具, 每天评估的功能移植13,23,24。
这些特点使这成为一个理想的模型, 分析早期移植损伤与长期保存期或不同的保存方案和技术。为了获得最佳的成功与这个模型, 必须考虑几个关键的步骤。胰腺本身很容易受到操控。因此, 在器官恢复和植入过程中使用棉花棒进行轻柔的处理能最大限度地减少机械损伤。应避免用钳直接抓取腺体, 因为这将不可避免地导致严重的移植损伤。由于同样的原因, 脾脏与胰腺一起被恢复, 并且被用作手柄。这也是建立在临床实践。进一步的陷阱包括冷灌注, 这是通过使用4° c 组氨酸-二灌注液灌注通过主动脉残端。因此, 通过轻轻灌注移植, 可以避免腺体过度肿胀。其余的灌注液应用于润湿移植物, 以使其在器官恢复过程中保持较低的温度。
对于接受者的准备, 仔细解剖外颈静脉和颈总动脉, 为成功的血管设置基础。特别是, 通过去除所有的支流, 而且周围的脂肪组织, 完全暴露的静脉, 是必要的, 以避免外部压迫和狭窄的残余脂肪组织。适当的袖口直径的选择是关键的。根据共同的经验, 对于体重在25到28克之间的小鼠来说, 动脉袖的内径为0.57 毫米, 在0.75 和0.8 毫米之间的静脉袖口是合适的。精确, 清洁的袖口边缘的切割是强制性的, 以避免撕裂的船只树桩。血管, 特别是动脉的扩张, 是利用血管 dilatators 的最佳方法。作为一个经验法则, 血管应该能够扩大到两倍的袖口的流明。在外翻的过程中, 把它固定在袖口上, 我们建议通过将血管夹放在皮瓣下使其稳定下来, 这样就能减轻这一关键步骤。
如上所述, non-suture 袖技术代表了一种简单的血管吻合方法, 可以在5分钟内完成。然而, 正确的定位移植在接受者的颈部区域是至关重要的正确的重建。因此, 必须对颈部区域的移植物的最终正确定位进行预测, 以保证静脉和动脉的安全、直接和无张力吻合。太长的船只必须避免, 因为这可能导致流出的障碍, 由于康祺。由于同样的原因, 在静脉吻合术中的袖柄也应在再灌注后去除。在胰腺移植局部 bleedings 的情况下, 用棉签轻轻按压出血侧5分钟即可取得成功的止血效果。这是唯一成功的方法来管理这种并发症。烧灼, 即使是高度选择性, 导致移植丢失几乎所有的情况下, 由于坏死性胰腺炎。
总之, 我们开发了一种方法, 在小鼠胰腺移植使用 non-suture 袖技术, 这是技术上和 microsurgically 可行的, 有很好的成功率。由于导管闭塞导致胰腺 progredient 纤维化, 因此该模型最适合于以早期移植损伤为重点的研究领域。这份手稿的目的是让研究人员在他们的实验室安全地建立这个模型。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了赠款 #2008-1-596 和 #UNI-0404/1956 的 “交响 Wissenschaftsfonds (TWF)” (https://www.tirol.gv.at/en/), 并通过赠款 #2013-042018 的 “梅-开始 Förderungsprogramm” 的医学大学因斯布鲁克。
Adventitia Scissors | S&T | S-00102 | Straight |
Dumont # 7 Forceps | FST | 11271- 30 | Curved Tip 0.17 x 0.1 mm |
Yasargil Clip Mini Permanent 7mm | Aesculap | FE720K | |
Micro vessel clip | S&T | B1 00396 V | |
Vessel dilatator | S&T | D-5a.2, 00125 | |
Clip applier | S & T | CAF-4 00072 | for venous cuff |
Clip applier | Aesculap | FE572K | for the arterial cuff |
Polyethylene tube | Portex Ltd | Inner diameter 0.75 mm for venous cuff | |
Polymide tubing | Vention Medical | 141-0051 | Inner diameter 0.8 mm (Alternative for polyethylene tube from Portex Ltd) |
Polymide tubing | Vention Medical | 141-0033 | Inner diameter 0.57 mm for arteriail cuff |
Bipolar forceps | Micromed | 140-100-015 | |
8/0 silk ligatures | Catgut GmbH, Merkuramed | 17209008 | |
Custodiol HTK solution | Dr. Franz Köhler Chemie | 59997 | |
Ketamin Graeub | aniMedica GmbH | 32554 | |
Xylasol Graeub | aniMedica GmbH | 50855 |