Blandt abdominal solid organtransplantation er pancreas grafts tilbøjelige til at udvikle svær iskæmi reperfusion skade-associerede graft skader, fører i sidste ende til tidlig graft-tab. Denne protokol beskriver en model af murine bugspytkirtel transplantation ved hjælp af en ikke-sutur manchet teknik, velegnet til at analysere disse tidlige, ødelæggende skader.
Musemodeller har flere fordele i transplantation forskning, herunder nem håndtering, en bred vifte af genetisk veldefinerede stammer og tilgængeligheden af det bredeste sortiment af molekylære sonder og reagenser til at udføre in vivo samt i vitro undersøgelser. Baseret på vores erfaring med forskellige murine transplantation modeller, udviklede vi en heterotopisk bugspytkirtel transplantation modellen i mus med hensigten at analysere mekanismerne bag svær iskæmi reperfusion skade-associerede tidlige graft skader. I modsætning til tidligere beskrive beskrevne teknikker ved hjælp af Sutur teknik, heri vi en ny procedure ved hjælp af en ikke-sutur manchet teknik.
I de seneste år, vi har udført mere end 300 bugspytkirtlen transplantationscentre i mus med en samlet succesraten for > 90%, en succesrate aldrig beskrevet før i mus bugspytkirtel transplantation. Rygraden i denne ikke-sutur manchet teknik for graft revaskularisering består af to hovedtrin: (I) trække modtagerfartøjets over en polyethylen/polyamid manchet og løse det med en omkredsen ligatur, og (II) placere donor fartøj over den everteret modtagerfartøjets og løse det med en anden omkredsen ligatur. Den resulterende kontinuitet i endothelial lag resultater i mindre trombogen læsioner med høj passage satser og endelig høj succesrate.
I denne model, er arterielle anastomose opnået ved at trække den abdominale aorta af donor graften over den everted fælles halspulsåren modtager dyret. Venøs dræning af graften opnås ved at trække portal venen af graften over den everted eksterne halsfedt af modtageren. Håndskriftet indeholder detaljer og afgørende skridt for det organ inddrivelse og orgel implantation procedurer, som giver forskere med microsurgical færdigheder til at udføre transplantation med succes i deres laboratorier.
Samtidige nyre-bugspytkirtel transplantation (SPK) repræsenterer den nuværende standard for pleje til patienter med diabetes mellitus og ende fase nyresygdom. Vellykket transplantation resulterer i langvarig insulin uafhængighed forbundet med stabilisering eller endog regression af diabetisk microangiopathy og en bedre livskvalitet i1. Men i modsætning til andre fælles solid orgel transplantationscentre, ligesom nyre og lever transplantation, pancreas grafts er mere modtagelige for iskæmi reperfusion skade (IRI). Rapporterede forekomst af op til 35% bringe ikke kun graft, men selv patient, overlevelse2,3.
Oxidativ stress, microcirculatory lidelser, øget udtryk af pro-inflammatoriske cytokiner og adhæsionsmolekyler resulterer endelig i endothelial aktivering og tab af sin integritet, er alle blevet tilskrevet denne ikke-allogene graft skade 4. hidtil har de præcise molekylære mekanismer af IRI er stort set ukendte og kan variere fra orgel til orgel.
Trods store fremskridt udnytte in vitro- modeller, er udviklingen af dyremodeller afgørende at uddybe kendskabet til molekylære mekanismer involveret i IRI-associerede graft ændringer efter bugspytkirtel transplantation. Flere bugspytkirtlen transplantation modeller er blevet udviklet i gnavere5,6, men kun én er rapporteret i mus7. Akilleshælen for denne meget krævende microsurgical procedure er den lave overlevelsesrate på 46%. Dog repræsenterer musemodeller den bedste model for transplantation-relateret forskning, da den bredeste vifte af Molekylær analyseværktøjer kan anvendes hertil. Baseret på omfattende microsurgical erfaring i mus med forskellige orgel transplantationscentrene8,9,10, udviklet vi en ny, meget reproducerbare teknik for heterotopisk, cervikal bugspytkirtlen transplantation i mus med > 90% succesrate ved hjælp af en ikke-sutur manchet teknik. Med denne teknik, anastomoser-relaterede komplikationer er reduceret til et minimum, og en høj succesrate kan opnås i forhold til sutur model11. Hidtil har er kun en musemodel med lignende succes satser blevet beskrevet af Liu mfl12. Men der er ingen undersøgelser offentliggjort via denne model indtil videre.
IRI-associerede graft skader er uløseligt forbundet med solid organtransplantation, og det er kendetegnet ved en forstyrrelser i mikrocirkulationen. Akkumulation af flere metabolitter i løbet af iskæmisk fase, og indledningen af inflammatoriske cascades medieret hovedsagelig af reaktive oxygen og nitrogen arter, resulterer i vævsskader under graft reperfusion4. Denne kaskade kan bringe ikke kun kortsigtede, men også langsigtet succes og dermed væsentligt påvirker patienter overlevelse14. Til dato, repræsenterer kombineret nyre bugspytkirtel transplantation behandling af valg for patienter med type 1 diabetes med end stage renal disease15. Flere undersøgelser har vist, at en vellykket kombineret nyre bugspytkirtel transplantation ikke kun genoprette og beskytte nyre graft funktion i diabetisk modtagere, men også stabiliserer eller selv vender sekundære komplikationer, herunder neuropati samt mikro- og nyresygdom16,17,18.
Trods vedvarende bestræbelser i reduktion, udskiftning og raffinement (3 R’s) i dyreforsøg er reproduktion af komplekse patofysiologiske processer som IRI blot umuligt i in vitro- indstillinger. Derfor er dyremodeller stadig anses for at være det ideelle værktøj for Translationel forskning19,20. Musemodeller som beskrevet her har flere fordele i forhold til rotten eller andre dyre modeller. Disse omfatter tilgængeligheden af et stort antal genetisk veldefinerede indavlede mus stammer (f.eks. stammer, transgene og knock-out), et væld af molekylære analyseværktøjer, samt en let og billig håndtering af21. En stor fordel ved den beskrevne model ligger i den ikke-sutur manchet teknik. Ved hjælp af den heri præsenteres teknik, succes satser for > 90% er opnåelig, hvilket er dramatisk bedre i forhold til tidligere beskrevne modeller22. Brug af denne ikke-sutur teknik reduceret vi betydeligt fælles komplikationer gerne Hypovolæmiske chok og trombose stenose af anastomoser12. En yderligere fordel ved denne metode består af ekstra abdominal placeringen af graft, der er forbundet med hurtig postoperative genopretning af modtageren. Derudover gør den cervikale placering det perfekt egnet til i vivo analyser, såsom live imaging af graften af exterioration uden nogen spænding22.
Den største ulempe ved denne model er okklusion af pancreas kanalen, som ikke ligner kliniske virkelighed. I denne model administreres eksokrine dræning ved at binde choledocho-pancreas kanalen. På lang sigt resulterer dette i en markant fibrose og atrofi af kirtel uden fører at pode pancreatitis22. På grund af denne forringelse af de eksokrine væv, som vi observerede så tidligt som i dag 30 efter transplantation, mener vi, at denne model ikke er egnet til lang sigt observation. I modsætning hertil gør den fejlfri endokrine funktion gylcemic kontrol af modtageren et nemt værktøj til daglig vurdering af funktionen af transplantat13,23,24.
Disse egenskaber gør det en ideel model til at analysere tidlige graft skader forbundet med lange bevarelse perioder eller med forskellige bevarelse løsninger og teknikker. For at opnå optimal succes med denne model, flere afgørende skridt skal tages i betragtning. Bugspytkirtlen selv er meget modtagelige for manipulation. Derfor minimerer skånsom håndtering ved hjælp af bomuld pinde under orgel opsving og under implantation mekanisk traume. Direkte fatte af kirtel med pincet bør undgås, da det vil uundgåeligt medføre alvorlige graft skader. Af samme grund, milten er et rentetillæg bugspytkirtlen, og bruges som et håndtag. Dette er også fastslået i klinisk praksis. En yderligere faldgrube indebærer kolde perfusion, som opnås ved perfusion via aorta stumpen ved hjælp af 4 ° C histidin-tryptophan-ketoglutarat perfusion løsning. Herved, kan en overdreven hævelse af kirtel undgås ved forsigtigt perfusing graften. De resterende perfusion løsning bør anvendes til fugtning graft, for at holde dens temperatur lav under organ inddrivelse.
Med hensyn til modtagerens forberedelse sætter en omhyggelig dissektion af både den eksterne halsfedt samt den fælles halspulsåren base for vellykket revascularisation. I særlige, komplet eksponering af vene ved at fjerne alle bifloder, men også de omkringliggende fedtvæv, er nødvendig for at undgå ekstern kompression og stenose af resterende fedtvæv. Udvælgelse af passende manchet diametre er afgørende. Baseret på fælles erfaring, for mus vejer mellem 25-28 g, er en indre diameter på 0.57 mm for arteriel manchet og mellem 0,75 og 0,8 mm for venøs manchet, passende. Præcise, ren opskæring af kanterne af manchetter er obligatorisk at undgå rive fartøj stump. Dilatation af fartøjer, især af arterie, opnås bedst ved hjælp af fartøjet dilatators med fine tips. Som en tommelfingerregel bør fartøjet kunne udvide til dobbelt lumen af manchetten. I løbet af processen af everting skibet og løse det på manchetten, anbefaler vi stabilisere vaskulære klemmer ved at placere dem under en hud flap, da dette letter dette afgørende skridt.
Som allerede nævnt, ikke sutur cuff-teknik repræsenterer en nem metode til vaskulær anastomose og kan udføres i 5 min. Korrekt positionering af graften i modtagerens halsregionen er imidlertid af allerstørste betydning for korrekte revaskularisering. Herved, må de endelige korrekt placering af graften i halsregionen forventes for at muliggøre en sikker, lige og spændingsfri anastomose af både venen og arterie. Fartøjer, der er for lange skal undgås, da dette kan medføre udstrømning obstruktion på grund af kinke. Af samme grund bør cuff-håndtag på den venøse anastomose også fjernes efter reperfusion. I tilfælde af lokaliserede blødninger fra pancreas graften, kan succesfuld hæmostase opnås ved forsigtigt komprimere den blødende side i 5 min ved hjælp af bomuld pinde. Dette er den kun succesfulde måde at håndtere denne form for komplikation.Ætsninger, selv om meget selektiv, resulterede i graft tab i næsten alle tilfælde, på grund af nekrotisk pancreatitis.
I Resumé udviklede vi en metode for bugspytkirtel transplantation i mus ved hjælp af en teknik, ikke-sutur manchet, som er teknisk og microsurgically muligt og har fremragende succesrate. I betragtning af progredient fibrose i bugspytkirtlen på grund af gaffatape okklusion, er denne model velegnet bedst til forskningsområder med fokus på tidlig graft skader. Dette manuskript er bestemt at lade forskere at sikkert fastslå denne model i deres laboratorier.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af tilskud #2008-1-596 og #UNI-0404/1956 af “Tiroler Wissenschaftsfonds (TWF)” (https://www.tirol.gv.at/en/), og grant #2013-042018 af “MUI-Start Förderungsprogramm” af det medicinske universitet Innsbruck.
Adventitia Scissors | S&T | S-00102 | Straight |
Dumont # 7 Forceps | FST | 11271- 30 | Curved Tip 0.17 x 0.1 mm |
Yasargil Clip Mini Permanent 7mm | Aesculap | FE720K | |
Micro vessel clip | S&T | B1 00396 V | |
Vessel dilatator | S&T | D-5a.2, 00125 | |
Clip applier | S & T | CAF-4 00072 | for venous cuff |
Clip applier | Aesculap | FE572K | for the arterial cuff |
Polyethylene tube | Portex Ltd | Inner diameter 0.75 mm for venous cuff | |
Polymide tubing | Vention Medical | 141-0051 | Inner diameter 0.8 mm (Alternative for polyethylene tube from Portex Ltd) |
Polymide tubing | Vention Medical | 141-0033 | Inner diameter 0.57 mm for arteriail cuff |
Bipolar forceps | Micromed | 140-100-015 | |
8/0 silk ligatures | Catgut GmbH, Merkuramed | 17209008 | |
Custodiol HTK solution | Dr. Franz Köhler Chemie | 59997 | |
Ketamin Graeub | aniMedica GmbH | 32554 | |
Xylasol Graeub | aniMedica GmbH | 50855 |