Bland buk solida organtransplantationer är bukspottskörteln ympkvistar benägna att utveckla svår ischemi reperfusion skada-associerade transplantat skador, leder så småningom till tidig transplantat förlust. Det här protokollet beskriver en modell av murina bukspottkörteln transplantation med en icke-sutur manschetten teknik, idealiskt för att analysera dessa tidiga, skadliga skador.
Musmodeller har flera fördelar i transplantationsforskning, inklusive enkel hantering, en mängd genetiskt väldefinierade stammar och tillgång till det bredaste utbudet av molekylär sonder och reagenser till utföra i vivo samt i vitro studier. Utifrån vår erfarenhet med olika murina transplantation modeller utvecklat vi en heterotopisk bukspottkörteln transplantation modell i möss med avsikt att analysera mekanismerna bakom svår ischemi reperfusion skada-associerade tidiga transplantat skador. I motsats till tidigare beskriver beskrivna tekniker med sutur teknik, häri vi ett nytt förfarande med en icke-sutur manschetten teknik.
Under de senaste åren har vi genomfört fler än 300 bukspottkörteln transplantationer hos möss med en övergripande framgång på > 90%, en framgång beskrivs aldrig innan i mus bukspottkörteln transplantation. Ryggraden i denna icke-sutur manschetten teknik för transplantat revaskularisering består av två viktiga steg: (I) drar det mottagande fartyget över en polyeten/polyamid manschett och fastställa det med en omkretsriktningen ligatur, och (II) att placera givaren fartyget över den vrängs mottagande fartyget och fixera det med en andra omkretsriktningen ligatur. Den resulterande kontinuiteten av endothelial lagret resulterar i mindre trombogen lesioner med hög patency priser och, slutligen, höga svarsfrekvenser.
I denna modell uppnås arteriell anastomos genom att dra bukaorta av givare transplantatet över den everted gemensamma halspulsådern av mottagarens djuret. Venös dränering av graften uppnås genom att dra portalen ven av transplantatet över den everted yttre halsvenen av mottagaren. Detta manuskript ger detaljer och avgörande steg av orgel återhämtning och orgel implantation förfaranden, som gör att forskare med mikrokirurgisk kompetens att utföra transplantationen framgångsrikt i sina laboratorier.
Samtidiga njure och bukspottkörtel transplantation (SPK) representerar den nuvarande standardbehandling för patienter som lider av diabetes mellitus och slutet njursjukdom. Lyckade transplantationen resulterar i långsiktiga insulin oberoende associerade med stabilisering eller ens regression av diabetes mikroangiopati och en bättre livskvalitet1. Men till skillnad från andra vanliga solida organtransplantationer, som njur- och levertransplantation, är bukspottskörteln ympkvistar mer mottagliga för ischemi reperfusionsskada (IRI). Rapporterade incidensen av upp till 35% äventyra inte bara transplantat, men även patienten, överlevnad2,3.
Oxidativ stress, mikrocirkulatoriska störningar, ökat uttryck av pro-inflammatoriska cytokiner och adhesionsmolekyler resulterar slutligen i endotel aktivering och förlust av sin integritet, alla tillskrevs denna icke-allogent transplantat skada 4. så långt, de exakta molekylära mekanismerna för IRI är till stor del okända och kan variera från organ till organ.
Trots stora framsteg utnyttja in vitro- modeller, är utvecklingen av djurmodeller avgörande för att fördjupa kunskapen om molekylära mekanismer som är involverade i IRI-associerade transplantat förändringar efter bukspottkörteln transplantation. Flera modeller för transplantation av bukspottkörteln har utvecklats i gnagare5,6, men enda rapporteras i möss7. Akilleshälen i denna mycket krävande mikrokirurgisk procedur är låga överlevnaden på 46%. Musmodeller utgör dock den bästa modellen för transplantation-relaterad forskning, eftersom den bredaste utbud av molekylär analysverktyg kan tillämpas på dem. Baserat på omfattande mikrokirurgisk erfarenhet hos möss med olika organ transplantationer8,9,10, utvecklat vi en ny, mycket reproducerbara teknik för heterotopisk, cervikal bukspottkörteln transplantation i möss med > 90% framgång med ett icke-sutur manschetten teknik. Med denna teknik, anastomoser-relaterade komplikationer reduceras till ett minimum, och en hög framgång kan uppnås jämfört med sutur modell11. Hittills har endast en musmodell med liknande svarsfrekvenser beskrivits av Liu et al12. Det finns dock inga studier som publicerats med hjälp av denna modell hittills.
IRI-associerade transplantat skador är inneboende solida organtransplantationer, och den kännetecknas av en störning av mikrocirkulationen. Ansamling av flera metaboliter under fasen ischemisk och inledandet av inflammatoriska kaskader medieras främst av reaktivt syre och kväve arter, resulterar i vävnadsskada under transplantat reperfusion4. Denna kaskad kan äventyra inte bara kortsiktigt, men också långsiktig framgång, och därför avsevärt påverkar patienter överlevnad14. I dag representerar kombinerade njurtransplantation bukspottkörteln terapin av val för patienter som lider av typ 1 diabetes med slutet skede njursjukdom15. Flera studier har visat att en framgångsrik kombinerade njurtransplantation bukspottkörteln inte bara återställa och skydda transplantat njurfunktion hos diabetiker mottagare, men också stabiliserar eller ens vänder sekundära komplikationer, inklusive neuropati som mikro- och protektion16,17,18.
Trots ständiga ansträngningar i minskning, ersättning och förfining (3 R’s) i djurförsök är reproduktion av komplexa patofysiologiska processer som IRI bara omöjligt i in vitro- inställningar. Djurmodeller anses därför fortfarande vara det idealiska verktyget för translationell forskning19,20. Musmodeller som den ovan beskrivna här har flera fördelar jämfört med råtta eller andra djur modeller. Dessa inkluderar tillgång till en stor mängd genetiskt väldefinierade inavlade mus stammar (t.ex. genmanipulerad och knock-out stammar), en uppsjö av molekylär analysverktyg, samt en lätt och billig hantering21. En stor fördel med den beskrivna modellen ligger i den icke-sutur manschett tekniken. Med hjälp av häri presenteras tekniken, framgång priser av > 90% kan uppnås, vilket är dramatiskt bättre jämfört med tidigare beskrivna modeller22. Med denna icke-sutur teknik, betydligt vi vanliga komplikationer som hypovolemi chock, trombos och stenos av anastomoser12. En ytterligare fördel med denna metod består av graften, som är associerad med snabb postoperativ återhämtning av mottagaren extra buk ställning. Dessutom gör det cervikala läget det perfekt för i vivo analyser, såsom levande avbildning av transplantat av exterioration utan någon spänning22.
Den största nackdelen med denna modell är ocklusion av bukspottkörtelns kanalen, som inte liknar kliniska verkligheten. I denna modell hanteras exokrina dränering genom att knyta choledocho-bukspottskörteln kanalen. På lång sikt resulterar detta i en uttalad fibros och atrofi av körteln utan leder till ympa pankreatit22. På grund av denna försämring av exokrin vävnad, som vi observerade så tidigt som på dag 30 efter transplantation, tror vi att denna modell inte lämpar sig för lång sikt observation. Däremot gör den unimpaired endokrina funktionen gylcemic kontroller av mottagaren ett enkelt verktyg för daglig bedömning av funktionen av transplantat13,23,24.
Dessa egenskaper gör detta till en idealmodell för att analysera tidig transplantat skador associerade med långa bevarande perioder eller med olika bevarande lösningar och tekniker. För att uppnå optimal framgång med denna modell, måste flera avgörande steg beaktas. Bukspottkörteln själv är mycket mottagliga för manipulation. Därför minimerar skonsam hantering med bomull-minnen under orgel återhämtning och under implantation mekanisk trauma. Direkt greppa körtel med pincett bör undvikas, eftersom det oundvikligen skulle leda till svår transplantat skador. Av samma anledning, mjälte återvinns tillsammans med bukspottkörteln, och används som ett handtag. Detta är också etablerat i klinisk praxis. En ytterligare fallgrop innebär kalla perfusion, vilket uppnås genom perfusion via aorta stubben med 4 ° C histidin-tryptofan-ketoglutarat perfusion lösning. Härmed kan en överdriven svullnad av körteln undvikas genom att försiktigt startas graften. Den återstående perfusion lösningen bör användas för att fukta transplantat, för att hålla temperaturen låg under orgel återhämtning.
När det gäller mottagarens förberedelse sätter en noggrann dissektion av både den yttre halsvenen samt den gemensamma halspulsådern basen för framgångsrika revaskularisering. I synnerhet, komplett exponering av ven genom att ta bort inte bara alla biflöden, men även omgivande fettvävnad, är nödvändigt för att undvika yttre kompression och stenos av återstående fettvävnad. Valet av lämpliga manschetten diametrarna är avgörande. Baserat på delade erfarenhet, för möss som väger mellan 25 till 28 g, är en inre diameter på 0.57 mm för arteriell manschetten och mellan 0,75 och 0,8 mm för venös manschetten, lämpligt. Exakt och ren skär av kanterna på ärmslut är obligatoriskt att undvika att slita fartyget stubben. Dilatation av fartygen, särskilt av artär, uppnås bästa med fartyget dilatators med fina tips. Som en tumregel, bör fartyget kunna öka till två gånger lumen av manschetten. Under processen med everting fartyget över och fastskruvning på manschetten, rekommenderar vi stabilisera vaskulär klämmor genom att placera dem under en hudfliken, eftersom detta underlättar detta avgörande steg.
Som redan nämnts, icke-sutur manschett-tekniken representerar en enkel metod för vaskulära anastomos och kan utföras inom 5 min. Rätt placering av transplantat i mottagarens halsen regionen är dock av yttersta vikt för korrekt revaskularisering. Härmed, har den slutliga korrekta positioneringen av transplantat i halsen regionen förutses för att möjliggöra en säker, raka och spänning-fri anastomos av både ven och artär. Fartyg som är för långa måste undvikas, eftersom detta kan leda till utflöde obstruktion på grund av veck. Av samma anledning bör manschett-handtaget på venös anastomos också avlägsnas efter reperfusion. I fall av lokaliserade blödningar från bukspottskörteln transplantat uppnås framgångsrik hemostas genom att försiktigt komprimera den blödande sidan för 5 min med bomull-minnen. Detta är det enda framgångsrika sättet att hantera denna typ av komplikation.Bränning, även om mycket selektiv, resulterade i transplantat förlust i nästan alla fall, på grund av nekrotiserande pankreatit.
Sammanfattningsvis har vi utvecklat en metod för bukspottkörteln transplantation hos möss med en icke-sutur manschetten teknik, som är tekniskt genomförbart och microsurgically och har utmärkt framgång priser. Med tanke på den progredient fibros i bukspottkörteln på grund av kanalen ocklusion, passar denna modell bäst för forskningsområden med fokus på tidig transplantat skador. Detta manuskript syftar till att låta forskare att säkert fastställa denna modell i sina laboratorier.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av bidrag nr 2008-1-596 och #UNI-0404/1956 av den ”Tiroler Wissenschaftsfonds (TWF)” (https://www.tirol.gv.at/en/), och av bidrag #2013-042018 av den ”MUI-Start Förderungsprogramm” av medicinska universitet Innsbruck.
Adventitia Scissors | S&T | S-00102 | Straight |
Dumont # 7 Forceps | FST | 11271- 30 | Curved Tip 0.17 x 0.1 mm |
Yasargil Clip Mini Permanent 7mm | Aesculap | FE720K | |
Micro vessel clip | S&T | B1 00396 V | |
Vessel dilatator | S&T | D-5a.2, 00125 | |
Clip applier | S & T | CAF-4 00072 | for venous cuff |
Clip applier | Aesculap | FE572K | for the arterial cuff |
Polyethylene tube | Portex Ltd | Inner diameter 0.75 mm for venous cuff | |
Polymide tubing | Vention Medical | 141-0051 | Inner diameter 0.8 mm (Alternative for polyethylene tube from Portex Ltd) |
Polymide tubing | Vention Medical | 141-0033 | Inner diameter 0.57 mm for arteriail cuff |
Bipolar forceps | Micromed | 140-100-015 | |
8/0 silk ligatures | Catgut GmbH, Merkuramed | 17209008 | |
Custodiol HTK solution | Dr. Franz Köhler Chemie | 59997 | |
Ketamin Graeub | aniMedica GmbH | 32554 | |
Xylasol Graeub | aniMedica GmbH | 50855 |