Användning av en monocyt Monolayer analys för att utvärdera Fcy-receptor-medierad fagocytos

Summary

The monocyte monolayer assay (MMA) is an in vitro assay that utilizes isolated primary monocytes obtained from mammalian peripheral whole blood to evaluate Fcγ receptor (FcγR)-mediated phagocytosis.

Abstract

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly versatile in vitro assay that can be modified to examine different aspects of antibody and Fcγ receptor (FcγR)-mediated phagocytosis in both research and clinical settings. The assay utilizes adherent monocytes from peripheral blood mononuclear cells isolated from mammalian whole blood. MMA has been described for use in both human and murine investigations. These monocytes express FcγRs (e.g., FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB, and FcγRIIIA) that are involved in immune responses. The MMA exploits the mechanism of FcγR-mediated interactions, phagocytosis in particular, where antibody-sensitized red blood cells (RBCs) adhere to and/or activate FcγRs and are subsequently phagocytosed by the monocytes. In vivo, primarily tissue macrophages found in the spleen and liver carry out FcγR-mediated phagocytosis of antibody-opsonized RBCs, causing extravascular hemolysis. By evaluating the level of phagocytosis using the MMA, different aspects of the in vivo FcγR-mediated process can be investigated. Some applications of the MMA include predicting the clinical relevance of allo- or autoantibodies in a transfusion setting, assessing candidate drugs that promote or inhibit phagocytosis, and combining the assay with fluorescent microscopy or traditional Western immunoblotting to investigate the downstream signaling effects of FcγR-engaging drugs or antibodies. Some limitations include the laboriousness of this technique, which takes a full day from start to finish, and the requirement of research ethics approval in order to work with mammalian blood. However, with diligence and adequate training, the MMA results can be obtained within a 24-h turnover time.

Introduction

The monocyte monolayer assay (MMA) is an in vitro assay originally developed to better predict blood transfusion outcomes in patients with auto- or alloantibodies to red blood cells (RBCs)^1-5. By assessing the effect of anti-RBC antibodies in mediating Fcγ receptor (FcγR)-mediated phagocytosis using this in vitro assay, it is possible to predict the clinical outcome in vivo. Indeed, the MMA has been used successfully to avoid immune destruction of antibody-bound RBCs, despite the transfusion of serologically incompatible blood⁵. The typical pre-transfusion procedure for compatibility testing, also termed crossmatching, involves serological methods that include typing the patient’s blood for ABO and Rh antigens and screening for the presence of anti-RBC antibodies in the patient⁶. Blood matched for ABO/Rh is selected, and if antibodies are present, an attempt to identify them is made so that blood for transfusion can be further selected to avoid these antigens. An ideal crossmatch result occurs when all donor blood is serologically compatible with the patient’s blood, which reduces the risk of post-transfusion hemolysis⁷. However, this system falls short for the small group of patients who have become alloimmunized upon repeated transfusion or pregnancy. These patients produce alloantibodies against specific RBC antigens. Some produce antibodies to antigens of very high frequency in the general population, and thus become progressively more difficult to crossmatch^8,9. Adding to the complexity, not all alloantibodies are clinically significant; in other words, the binding of an alloantibody to RBCs detected by a serology test does not necessarily result in hemolysis when antigen-positive, incompatible blood is transfused. The MMA was originally developed to assess the potential clinical significance of serologically incompatible blood in a transfusion setting^1-5.

Since extravascular hemolysis of antibody-bound RBCs is known to be mediated by the mononuclear phagocyte system, primary monocytes/macrophages are utilized in the development of diagnostic assays. The first assay to study the interaction of monocytes, RBCs, and antibodies was published in 1975, but the sub-optimal conditions used led only to rosette formation (the binding of RBCs to the periphery of the monocyte), and no phagocytosis was observed¹⁰. Significant modifications to the assay were made by several groups, leading to an assay for which the level of phagocytosis of alloantibody-bound RBCs could be correlated to the clinical outcome of hemolysis^1-5. Recently, the optimal storage conditions of clinical samples and further optimization of assay conditions were examined to enhance the utility of a clinical MMA crossmatch using autologous patient samples¹¹.

Three other diagnostic techniques have been employed in addition to the MMA in predicting transfusion outcomes: the ⁵¹Cr release test, the rosette test, and the chemiluminescence test (CLT). In the ⁵¹Cr release test, the patient is injected with ⁵¹Cr-labeled donor RBCs, and the half-life of the labeled RBCs is monitored and is predictive of post-transfusion survival or clearance^12,13. As this method uses radioactive materials, it is rarely performed anymore. The rosette test involves mixing and incubating monocytes with RBCs and quantifying the level of rosette formation (with no phagocytosis)¹⁴. The clinical significance of antibodies in vivo involves active phagocytosis by macrophages found in the spleen and/or the liver; thus, this method does not provide a relevant readout of phagocytosis. The CLT uses luminol to monitor the oxidative burst during monocyte phagocytosis of RBC, since luminol fluoresces blue when oxidized in the phagosome¹⁵. This method is good, but contamination by neutrophils can confound the readout. Parallel comparisons have been made to evaluate the sensitivity, practicality, and reproducibility of the four available methods, and both the CLT and MMA were ranked superior¹⁶. However, the CLT has been mainly utilized in assessing hemolytic disease of the fetus and newborn (HDFN), and the assay’s optimal pH of 8.0 might compromise the level of phagocytosis¹¹.

In addition to its diagnostic and clinical utility, the MMA has been modified for other research purposes. Indeed, the MMA can not only serve as a functional assay to address discrepancies between serology and biology, it has also been used to retrospectively investigate the cause of hemolysis after intravenous immunoglobulin (IVIG) therapy¹⁷. It has also been used to examine the structure-function of chemical inhibitors of FcγR-mediated phagocytosis^18-20 and to study the downstream signaling of FcγR-mediated phagocytosis²¹. In our laboratory, in addition to using a human MMA, we are developing a murine MMA using primary mouse peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and autologous RBCs. The rationale is to screen antibodies that can induce FcγR-mediated phagocytosis as an intermediate to developing an in vivo autoimmune hemolytic anemia (AIHA) mouse model (unpublished data). The various modifications focus on different aspects of the IgG antibody and FcγR interaction that induce phagocytosis.

Protocol

Erhålla godkännande för användning av humana prover av forskningsetik styrelse / Institutional Review Board, och få skriftliga medgivande från alla mänskliga donatorer. MMA kan även utföras med användning av mus-PBMC på ett liknande sätt som den mänskliga analys, följande animaliska användningsetik godkännande. MMA använder aseptisk vävnadsodlingstekniker. OBS: Se figur 1. OBS: Även om vi rekommenderar användning av en nivå 2 biologisk inneslutning skåp under analysen för att bibehålla aseptisk teknik, eftersom metoden är bara en "kort sikt" odlingsmetoden, det är egentligen inte tillräckligt med tid för bakterier att förorena analysen. Därför, om en nivå 2 biologisk inneslutning skåpet inte existerar, istället för att köpa en bara för denna analys, analysen kunde utföras utanför en biologisk inneslutning skåp, på en öppen bänk. Användning av en 37 ° C inkubator med 5% CO2, är dock inte ett alternativ och måste användas föroptimala resultat. 1. Perifera mononukleära blodcellisolering Erhålla humant helblod från en frisk donator eller en patient via venpunktion med användning Vacutainers innehållande syra-citrat-dextros (ACD) antikoagulans (gul-top-rör). OBS: Helblod kan lagras i ACD vid rumstemperatur (18-22 ° C) i upp till 36 timmar innan man går vidare till nästa steg 11. Normalt, 1-2 10-ml-vacutainerrör helblod är tillräckliga för analysen. Späd helblodet 1: 1 volym / volym i varmt fullständigt RPMI-medium (RPMI-1640 kompletterat med 10% fetalt bovint serum, 20 mM HEPES och 0,01 mg / ml gentamicin). Isolera perifera mononukleära blodceller (PBMC) från utspätt helblod med hjälp av densitetsgradientcentrifugering, som rekommenderas av tillverkaren (se lista över material). Layer det utspädda blodet mycket långsamt över densitetsgradient (värmdes till rumstemperatur, 18-22 ° C). OBS: Minimera mängden mixing vid gränsytan för optimal separation av blod genom att noggrant skiktning av blodblandningen droppvis eller med hjälp av en pipett. Tillåta blodblandningen att långsamt lager över toppen av densitetsgradient genom att placera pipettspetsen nära densitetsgradienten och genom att möjliggöra för blodblandningen att rinna ner längs sidan av röret mycket långsamt. Beroende på skalan av experimentet, skiktet 10 mL blod blandningen på toppen av 3 ml densitetsgradient (i en 15-ml rör) eller skiktet 35 mL blod blandningen på toppen av 15 ml av densitetsgradient (i en 50-ml rör). Typiskt, 10 ml helblod ger 10 miljoner PBMC, med några donator-till-donator variation. OBS: Det är mycket viktigt att det inte finns någon blandning av blodet blandning med den densitetsgradient. Blodblandningen bör lager över densitetsgradienten och långsamt stiga tills allt blod är på toppen av den densitetsgradient. Centrifugera den skiktade blandningen vid 700 xg under 30 min utan bromsar. centrifuged blandningen bör separera i 5 lager (uppifrån och ner): plasma, buffy coat (innehållande PBMC), densitetsgradientmaterial, granulocyter, och RBC. Ta bort och kasta den största delen av plasma och noggrant hämta innehållet buffy coat (PBMC) i en ny 15-ml rör med hjälp av en pasteurpipett och en sugan glödlampa. OBS: Avlägsnandet av koncentratskiktet är i praktiken göras genom att applicera sug på pasteurpipett när de utför en cirkelrörelse runt utsidan av skiktet, med spetsen av pipetten mot röret. Tvätta de isolerade PBMC tre gånger i pH 7,3 fosfatbuffrad saltlösning (PBS) genom centrifugering vid 350 xg under 10 min (med fulla bromsar) i mellan tvättar. Rekonstituera PBMC pelleten i komplett RPMI-medium. Beroende på storleken av pelleten, är tillräcklig 3-7 ml medium. Räkna PBMC med hjälp av trypanblått och en hemocytometer. Bara räkna de celler som inte färgas av trypanblått. Reconstitute PBMC till 1.750.000 celler / ml i komplett RPMI-medium. Seed 400 | il (700.000 celler) i varje brunn i en 8-kammarobjektglas. Inkubera objektglaset i ett 37 ° C, fullständigt humidifierad vävnadsodlingsinkubator (som kompletterats med 5% CO2) under 1 h för att göra det möjligt för monocyt / makrofager att vidhäfta. 2. Förbehandling vidhäftat Monocyter OBS: Detta steg är endast nödvändigt om letar efter sätt att hämma eller förstärka fagocytos. Pre-treat vidhäftade monocyter med någon drog (er) eller förening (ar) av intresse. Bered läkemedlet (s) eller annat provmaterial till den önskade koncentrationen med hjälp av komplett RPMI-medium. OBS: Till exempel är 200 | ig / ml IVIG som typiskt används för att ge en 95-100% -ig hämning av fagocytos vid användning av humana monocyter. Aspirera och kasta supernatanten innehållande eventuella icke-vidhäftande celler från 8-kammarobjektglas efter en-h inkubation (efter steg 1,6). Ersätta det med 400mikroliter av ett läkemedel eller annan behandling och inkubera under 1 h vid 37 ° C. När aspire och ersätta lösningar i 8-kammar bild, se till att styra flödet av vätskor så att svagt vidhäftade celler inte lyfta. Också, arbeta med endast 2-3 tomma brunnar åt gången och undvika att torka brunnarna. OBS: Normalt är varje behandling utförs i tekniska triplikat. 3. opsonisering av R 2 R 2 röda blodkroppar OBS! R2 R2 används här erhålls från Blood Collection Center (kanadensiska Blood Services), men de är också kommersiellt tillgängliga. Opsoniserad R2 R 2 RBC används som en positiv kontroll för FcyR-medierad fagocytos. Naiv R 2 R 2 bör förvaras i Alsevers lösning (för att förlänga hållbarheten) vid 4 ° C i upp till en månad. Alsevers lösning görs internt och består av 0,8% Vikt / volym trinatriumcitrat (dihydrat), 1,9% vikt / volym dextros, 0,42% vikt / volym natriumklorid, och 0,05% vikt / volym citronsyra (monohydrat). Om R 2 R 2-celler inte finns tillgängliga, andra Rh-fenotypades celler, såsom R 1 R 2, R 1 R 1, R 1 r, eller R 2 r, kan användas. Tvätt R 2 R 2 (CDE / CDE) röda blodkroppar i PBS totalt tre gånger med användning av centrifugering vid 350 xg under 5 min vardera. OBS: Mängden av de röda blodkropparna som behövs beror på den experimentella storlek och kan vara back-beräknas. Tvätta alltid ett överskott av röda blodkroppar, eftersom de röda blodkropparna försvinner under varje tvätt på grund av lys eller under avlägsnandet av supernatanten. Till exempel, i ett experiment med 5 behandlingar och 2 kontroller, alla utförda i tekniska triplikat, finns totalt 21 brunnar. 21 brunnar med 400 | il / brunn av 1,25% RBC blandningen indikerar att 105 | il av packade, opsoniserad RBC behövs. 200 mikroliter av RBC bör först tvättas och 150 & #181; L bör opsoniserad att säkerställa att det finns en tillräcklig mängd RBC för fagocytos steg. Opsonisera den tvättade R 2 R 2 pelleten med 1: 1 vol / vol polyklonala anti-D-antikroppar från humanserum och inkubera i 1 h vid 37 ° C, med intermittent blandning. OBS: Om polyklonala anti-D-antikroppar inte är tillgängliga, är det möjligt att använda monoklonala anti-D-antikroppar, som är kommersiellt tillgängliga, eller anti-D som normalt används för Rh immunprofylax, som kan erhållas från blodbanker eller transfusion tjänster. Optimering testning bör utföras i början, när du installerar analysen och när man byter massor av un-titer polyklonala antikroppar eller byta till en monoklonal antikropp. Detta för att identifiera den optimala koncentrationen eller volymen av anti-D som krävs för en antiglobulintest (IAT) följd av mellan 3+ och 4+ och fagocytos resultat på mellan 70-90 fagocyterade RBC per 100 monocyter räknades. Tvätta opsoniserad R 2 R 2 totalt tre gånger i PBS med hjälp av centrifugering vid 350 xg under 5 min vardera. OBS: Framgångsrik opsonisering av R2 R 2 kan bekräftas genom att utföra en indirekt IAT. I korthet sekundära polyklonala anti-humana antikroppar tillsätts för att binda primära opsoniserande antikroppar på RBC-ytor, och den förstärkta signalen kan observeras i form av hemagglutination. En detaljerad tillverkaren protokoll kan hittas i det kompletterande material filen. Bered den tvättade R2 R2 pellet till 1,25% v / v med hjälp av komplett RPMI-medium. OBSERVERA: Överflödigt opsoniserad R 2 R 2 kan lagras i Alsevers lösning vid 4 ° C i upp till en vecka. 4. Fc-receptor-medierad fagocytos Aspirera läkemedlet eller medium supernatant från 8-kammarobjektglas och tillsätt 400 mikroliter av 1,25% v / v R 2 R 2-blandning. Inkubera vid 37 ° C under 2 h. Akterer 2 h inkubation, ta bort kamrarna med hjälp av tillverkarens adaptrar. DAB bort överflödigt R 2 R 2 på en pappershandduk. Se till att sliden inte torkar ut. Fyll en 100 ml bägare med PBS. Sänk och tvätta bilden genom att långsamt flytta sliden fram och tillbaka (ca 30-40 slag) för att avlägsna huvuddelen av FN-fagocyteras R2 R2. Ta bort bilden från PBS. DAB bort överflödigt PBS med användning av en pappershandduk eller tissue och lufttorka sliden. Fixera den lufttorkade objektglaset i 100% metanol under 45 s. Därefter lufttorka den fasta sliden. OBS: Slides kan fastställas med hjälp av en annan metod som är mer kompatibel för nedströms färgning, såsom Grünwald-Giemsa fläcken 21 eller Wright-Giemsa fläcken 22. Montera bilden med hjälp av en in-house-made Elvanol monteringsmedium (eller annan kommersiellt tillgänglig monteringsmedium) och lägga täck. OBS: Elvanol monteringsmedium är sammansatt av 15% vikt / volym polyvinyl alkohol harts och 30% vol / vol glycerol i PBS. Blandningen upphettas tills allt hartset har lösts upp och glycerinet är homogent blandade. Detta kan ersättas med andra kommersiellt tillgängliga monteringsmedium. Låt fästet torka över natten innan kvantifiering. 5. Kvantifiering av fagocytos Med användning av ett faskontrastmikroskop och en 40X objektivlins, kvantifiera manuellt mängden fagocytiska händelser genom att räkna minst 200 monocyter och antalet fagocyteras R 2 R 2 inom dessa monocyter. Har en disk i varje hand för att samtidigt kvantifiera antalet monocyter och antalet fagocyteras R2 R2. Få den genomsnittliga fagocytiska index genom att dividera antalet fagocyteras R2 R2 med antalet monocyter och multiplicera med 100. Express data som medelvärdet (genomsnittet fagocytiska index) ± standardfelet av medelvärdet (SEM). </li>

Representative Results

Genom att följa de avgörande stegen i figur 1 och det förfarande som beskrivs ovan kan MMA reproducerbart utföras. IVIG användes som ett exempel för inhibering av fagocytos i figur 2. IVIG är känd för att binda och blockera Fc-receptorer, vilket hämmar nedströms resultatet av fagocytos. Genom titrering av mängden IVIG används, en dosberoende hämning observer där koncentrationer över 200 mikrogram / ml resulterade i nära 100% inhibition och koncentrationer under 0,5 mikrogram / ml hämmade inte alls (Figur 2A). När de fagocytiska index omvandlas och normaliserade till R 2 R 2 positiv kontroll som 0% inhibition, en inhibitionskurva med ett IC50 av 3 | j, g / ml kan bestämmas (figur 2B). Förutom att utföra analysen konsekvent quantificaning av analysen kan ibland vara svårt. Figur 3 är en samling av faskontrastmikroskopi bilder av olika MMA diabilder. Med mikroskopi erfarenhet kan man urskilja en monocyt från en kontaminerande RBC (Figur 3D) eller en vakuol från en fagocyteras RBC (figur 3B). Täta kluster av celler och / eller skräp bör undvikas under kvantifiering (figurerna 3E och F). Dessutom bör man undvika över opsoniserande R 2 R2 RBC, vilket skulle leda till ökad fagocytos som overcrowds monocyt interiör och stör exakt kvantifiering (Figur 3C). Figur 1. Schematisk beskrivning av MMA. Ett steg-för-steg-skildring av de avgörande stegen i MMA: isolera PBMC från helblod, mata det vidhäftade monocytes med opsoniserad R 2 R 2, och tvättning av kammare diabilder. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 2. Intravenös IgG (IVIG) hämmar fagocytos in vitro med hjälp av MMA. IVIG är känd för att inhibera fagocytos och används som en inhibering kontroll i humana MMA. (A) Titrering av IVIG resulterade i en dosberoende hämning av fagocytos jämfört med obehandlade R2 R2 kontroll. Resultaten visar medelvärdet ± standardfelet för medelvärdet (SEM) av n = 3 experiment. Den statistiska analysen genomfördes med hjälp av Student t-test: ** P≤0.01 och *** P≤0.001. (B) Hämning kurvan för IVIG med ett IC 50 of 3 | ig / ml (prickad linje). Resultaten visar data som normaliserade till obehandlad R 2 R 2 (0% hämning); medelvärde ± SEM av n = 3 experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 3. faskontrastmikroskopi bilder av provglasen enligt 40X förstoring. (A) Den perfekta bilden i vilken monocyterna fagocyteras 1-2 R2 R2 i genomsnitt (svarta pilar med en distinkt halo glöd), med mycket få förorenande, un-fagocyteras R2 R2 i bakgrunden (vita pilar). (B) Såsom visas i denna bild, monocyter ibland har förstorade vakuoler (vita pilar), vilket kan misstas för fagocyteras R2 R2. (C </ strong>) När R2 R2 har varit över opsoniserad, mer än 4-5 fagocyteras R2 R2 per monocyt (svarta pilar) gör exakt räkna svårt, eftersom R2 R2 trängs inom monocyt- och distinkta cell gränser kan inte särskiljas. (D) Otillräcklig tvättning av bilden leder till riklig R2 R2 föroreningar (vita pilar), vilket skulle kunna misstas för vidhäftade röda blodkropparna. (E) Ibland monocyter och kontaminerande röda blodkropparna kan bilda kluster. Kluster visar också bakteriell kontamination, vilket bör undvikas. (F) Monocyter kan bilda större aggregat, som bör undvikas under kvantifiering. Genom att använda slumpmässigt urval av fälten för att se, är panel A vad som brukar observeras om MMA har utförts på rätt sätt. Skala bar är 20 nm. Klicka häratt se en större version av denna siffra.

Discussion

MMA är en mödosam teknik som kräver kompetens inom både vävnadsodling och mikroskopi. Det finns flera viktiga steg för att säkerställa framgång: 1) generering av monocyt monolager; 2) opsonisering av RBC, och 3) manuell kvantifiering. Monocyt monolager fastnar inte mycket starkt till kammaren bilden, så fysiologiskt pH måste upprätthållas under hela analysen ¹¹ och ett tillräckligt antal PBMC bör ympas. Kraftig pipettering, som kan störa de vidhäftade cellerna, bör undvikas. Ett tillvägagångssätt är att alltid ta bort och lägga till lösningar från samma hörn av kammaren och för att säkerställa att rörelsen är långsam och stadig. På liknande sätt, under det sista tvättsteget för att avlägsna överskottet av RBC: er, bör rörelsen vara långsam och stadig. Detta säkerställer minimal störning till monolager samtidigt ta bort de flesta av de FN-fagocyteras RBC. Otillräcklig tvättning kommer att leda till en hög bakgrund av förorenande RBC, vilket gör manuell quantification svårt. För det andra måste _R2 R ₂ RBC vara tillräckligt opsoniserad att erhålla en genomsnittlig fagocytiska index på 80-120 för fagocytos kontroll. Detta önskade fagocytisk intervall en avvägning mellan enkel räkning (t.ex. monocyter med mer än 5 fagocyteras RBC är svårt att exakt kvantifiera) och upprätthålla en tillräcklig mängd fagocytos för statistisk analys. Graden av opsonisering kan bekräftas genom ett IAT, och en läsning mellan 3+ till 4+ behövs. R ₂ R ₂ RBC ska kasseras när det finns överskott lys under tvättning, när supernatanten blir mörkt röd, eller när en signifikant minskning av fagocytos observeras i experiment på grund av den åldrande av cellerna i lager. Slutligen kan manuell kvantifiering med hjälp av mikroskop vara svårt, särskilt när man jämför räknas mellan labbpersonal och mellan experiment. Genom att undersöka samma fält i varje brunn, eller helt enkelt genom att räkna flera cellerKan en mer konsekvent räkna erhållas. Side-by-side utbildning med en erfaren tekniker och använder sig av en uppsättning av utbildnings glider rekommenderas.

En viktig kritik av MMA är subjektivitet manuell kvantifiering steg. Men med lämplig utbildning, konsistens kan erhållas på olika diskar. En annan begränsning är inneboende donator-to-givare skillnader i monocyt fagocytiska förmågor och i _{R2 R2} ytantigen uttrycksnivåer, som är en datakälla variation när det handlar om mänskliga prov.

Andra alternativa metoder är tillgängliga för att pröva FcyR-medierad fagocytos. Majoriteten av kommersiella kit utnyttjar fluorescerande utgång för att övervaka fagocytos (t.ex. biopartiklar, pH-känsliga fluorescerande protein, eller IgG-märkta fluorescerande latexpärlor). Användningen av fluorescerande utgång inte erbjuder mer objektiv kvantifiering, men man måste också consider den tillgänglighet, kostnad, och träning i samband med användning av ett fluorescensmikroskop eller en flödescytometer, såväl som den efterföljande beroende av kommersiellt tillgängliga kit.

Slutligen kan denna analys modifieras beroende på frågeställningen. Till exempel, när man testar hämning av fagocytos, monocyter kan antingen förbehandlas eller saminkuber med både droger och opsoniserade RBC (dvs. en konkurrensanalys). Nedströmssignaleringen av antikroppar av olika subtyper, chimära antikroppar eller rekombinanta konstruktioner kan också testas. Med de senaste genombrott i utvecklingen av en universell antigen-null blod ^24, skulle MMA utnyttjas i första skärmar av dessa antigen null RBC med olika antikroppar för att bedöma om det faktiskt finns en sänkt effektivitet i att utlösa fagocytos.

Materials

Acid citrate dextrose (ACD) vacutainers	BD	REF364606
RPMI 1640	Sigma	R8758
HEPES	Bioshop	HEP003.100
Fetal bovine serum	Multicell	080150
Gentamicin	Gibco	15710-64
Ficoll-Paque PLUS	GE	17-1440-03	https://www.gelifesciences.com/
Phosphate buffered saline	Sigma	D8537
8-chamber slides	Lab-Tek-ll	154534
R2R2 (cDE/cDE) red blood cells	Canadian Blood Services		Commercially available (e.g. http://www.bio-rad.com/en-ca/product/reagent-red-blood-cells)
Polyclonal anti-D from human serum	Gamma Biologics	DIN 02247724	Can be substituted with commercially available monoclonal anti-D or with Rh immune globulin
100% methanol	Caledon	6700-1-42
Polyvinyl alcohol resin	Sigma	P8136	Can be substituted with commercially available mount
UltraPure glycerine	Invitrogen	15514-011
Cover slips	VWR	48366 067
Novaclone anti-IgG	Immucorgamma	5461023	Optional for IAT (http://www.fda.gov/downloads/biologicsbloodvaccines/…/ucm081743.pdf)