استخدام الوحيدات أحادي الطبقة الفحص لتقييم البلعمة بوساطة مستقبلات Fcγ

Summary

The monocyte monolayer assay (MMA) is an in vitro assay that utilizes isolated primary monocytes obtained from mammalian peripheral whole blood to evaluate Fcγ receptor (FcγR)-mediated phagocytosis.

Abstract

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly versatile in vitro assay that can be modified to examine different aspects of antibody and Fcγ receptor (FcγR)-mediated phagocytosis in both research and clinical settings. The assay utilizes adherent monocytes from peripheral blood mononuclear cells isolated from mammalian whole blood. MMA has been described for use in both human and murine investigations. These monocytes express FcγRs (e.g., FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB, and FcγRIIIA) that are involved in immune responses. The MMA exploits the mechanism of FcγR-mediated interactions, phagocytosis in particular, where antibody-sensitized red blood cells (RBCs) adhere to and/or activate FcγRs and are subsequently phagocytosed by the monocytes. In vivo, primarily tissue macrophages found in the spleen and liver carry out FcγR-mediated phagocytosis of antibody-opsonized RBCs, causing extravascular hemolysis. By evaluating the level of phagocytosis using the MMA, different aspects of the in vivo FcγR-mediated process can be investigated. Some applications of the MMA include predicting the clinical relevance of allo- or autoantibodies in a transfusion setting, assessing candidate drugs that promote or inhibit phagocytosis, and combining the assay with fluorescent microscopy or traditional Western immunoblotting to investigate the downstream signaling effects of FcγR-engaging drugs or antibodies. Some limitations include the laboriousness of this technique, which takes a full day from start to finish, and the requirement of research ethics approval in order to work with mammalian blood. However, with diligence and adequate training, the MMA results can be obtained within a 24-h turnover time.

Introduction

The monocyte monolayer assay (MMA) is an in vitro assay originally developed to better predict blood transfusion outcomes in patients with auto- or alloantibodies to red blood cells (RBCs)^1-5. By assessing the effect of anti-RBC antibodies in mediating Fcγ receptor (FcγR)-mediated phagocytosis using this in vitro assay, it is possible to predict the clinical outcome in vivo. Indeed, the MMA has been used successfully to avoid immune destruction of antibody-bound RBCs, despite the transfusion of serologically incompatible blood⁵. The typical pre-transfusion procedure for compatibility testing, also termed crossmatching, involves serological methods that include typing the patient’s blood for ABO and Rh antigens and screening for the presence of anti-RBC antibodies in the patient⁶. Blood matched for ABO/Rh is selected, and if antibodies are present, an attempt to identify them is made so that blood for transfusion can be further selected to avoid these antigens. An ideal crossmatch result occurs when all donor blood is serologically compatible with the patient’s blood, which reduces the risk of post-transfusion hemolysis⁷. However, this system falls short for the small group of patients who have become alloimmunized upon repeated transfusion or pregnancy. These patients produce alloantibodies against specific RBC antigens. Some produce antibodies to antigens of very high frequency in the general population, and thus become progressively more difficult to crossmatch^8,9. Adding to the complexity, not all alloantibodies are clinically significant; in other words, the binding of an alloantibody to RBCs detected by a serology test does not necessarily result in hemolysis when antigen-positive, incompatible blood is transfused. The MMA was originally developed to assess the potential clinical significance of serologically incompatible blood in a transfusion setting^1-5.

Since extravascular hemolysis of antibody-bound RBCs is known to be mediated by the mononuclear phagocyte system, primary monocytes/macrophages are utilized in the development of diagnostic assays. The first assay to study the interaction of monocytes, RBCs, and antibodies was published in 1975, but the sub-optimal conditions used led only to rosette formation (the binding of RBCs to the periphery of the monocyte), and no phagocytosis was observed¹⁰. Significant modifications to the assay were made by several groups, leading to an assay for which the level of phagocytosis of alloantibody-bound RBCs could be correlated to the clinical outcome of hemolysis^1-5. Recently, the optimal storage conditions of clinical samples and further optimization of assay conditions were examined to enhance the utility of a clinical MMA crossmatch using autologous patient samples¹¹.

Three other diagnostic techniques have been employed in addition to the MMA in predicting transfusion outcomes: the ⁵¹Cr release test, the rosette test, and the chemiluminescence test (CLT). In the ⁵¹Cr release test, the patient is injected with ⁵¹Cr-labeled donor RBCs, and the half-life of the labeled RBCs is monitored and is predictive of post-transfusion survival or clearance^12,13. As this method uses radioactive materials, it is rarely performed anymore. The rosette test involves mixing and incubating monocytes with RBCs and quantifying the level of rosette formation (with no phagocytosis)¹⁴. The clinical significance of antibodies in vivo involves active phagocytosis by macrophages found in the spleen and/or the liver; thus, this method does not provide a relevant readout of phagocytosis. The CLT uses luminol to monitor the oxidative burst during monocyte phagocytosis of RBC, since luminol fluoresces blue when oxidized in the phagosome¹⁵. This method is good, but contamination by neutrophils can confound the readout. Parallel comparisons have been made to evaluate the sensitivity, practicality, and reproducibility of the four available methods, and both the CLT and MMA were ranked superior¹⁶. However, the CLT has been mainly utilized in assessing hemolytic disease of the fetus and newborn (HDFN), and the assay’s optimal pH of 8.0 might compromise the level of phagocytosis¹¹.

In addition to its diagnostic and clinical utility, the MMA has been modified for other research purposes. Indeed, the MMA can not only serve as a functional assay to address discrepancies between serology and biology, it has also been used to retrospectively investigate the cause of hemolysis after intravenous immunoglobulin (IVIG) therapy¹⁷. It has also been used to examine the structure-function of chemical inhibitors of FcγR-mediated phagocytosis^18-20 and to study the downstream signaling of FcγR-mediated phagocytosis²¹. In our laboratory, in addition to using a human MMA, we are developing a murine MMA using primary mouse peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and autologous RBCs. The rationale is to screen antibodies that can induce FcγR-mediated phagocytosis as an intermediate to developing an in vivo autoimmune hemolytic anemia (AIHA) mouse model (unpublished data). The various modifications focus on different aspects of the IgG antibody and FcγR interaction that induce phagocytosis.

Protocol

الحصول على موافقة لاستخدام العينات البشرية من قبل المجلس / مجلس المراجعة المؤسسية أخلاقيات البحث، والحصول على موافقة موقعة من جميع الجهات المانحة الإنسان. مجلس العمل المتحد ويمكن أيضا أن يقوم باستخدام PBMCs الماوس بطريقة مماثلة لفحص البشري، بعد موافقة أخلاقيات استخدام الحيوانات. مجلس العمل المتحد تستخدم تقنيات زراعة الأنسجة العقيم. ملاحظة: انظر الشكل 1. ملاحظة: على الرغم من أننا نوصي استخدام الاحتواء البيولوجي مجلس الوزراء مستوى 2 خلال فحص للحفاظ على تقنية العقيم، كأسلوب ليست سوى "على المدى القصير" طريقة والثقافة، وليس هناك وقت حقا ما يكفي للبكتيريا لتلويث الفحص. ولذلك، إذا لم يكن موجودا الاحتواء البيولوجي مجلس الوزراء مستوى 2، بدلا من شراء واحدة فقط لهذا الفحص، يمكن إجراء فحص خارج مجلس الوزراء الاحتواء البيولوجي، على مقاعد البدلاء مفتوحة. استخدام الحاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2، ومع ذلك، ليس خيارا، ويجب أن تستخدم لالنتائج المثلى. 1. الدم المحيطي وحيدات النوى عزل الخلايا الحصول على الدم الكامل البشري من متبرع سليم أو المريض عن طريق بزل الوريد باستخدام vacutainers التي تحتوي على حمض سترات الدكستروز (ACD) تخثر (الأصفر أعلى أنابيب). ملاحظة: الدم كله يمكن تخزينها في حوار التعاون الآسيوي في درجة حرارة الغرفة (18-22 درجة مئوية) لمدة تصل إلى 36 ساعة قبل الانتقال إلى الخطوة التالية (11). عادة، 1-2 10 مل أنابيب vacutainer من الدم الكامل كافية للفحص. تمييع الدم الكامل 1: 1 ت / ت في حارة كاملة المتوسطة RPMI (RPMI-1640 تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني، 20 ملي HEPES، و 0.01 ملغ / مل الجنتاميسين). عزل الخلايا الطرفية وحيدة النواة في الدم (PBMCs) من الدم الكامل المخفف باستخدام الكثافة الطرد المركزي التدرج، على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة (انظر قائمة من المواد). طبقة من الدم المخفف ببطء شديد على مدى التدرج الكثافة (درجة حرارة لدرجة حرارة الغرفة، 18-22 درجة مئوية). ملاحظة: تقليل كمية للانترنتنانوغرام في واجهة لفصل الأمثل من الدم عن طريق طبقات بعناية الخليط الدم بطريقة قطرة قطرة أو باستخدام ماصة. السماح للخليط الدم إلى طبقة ببطء فوق الجزء العلوي من التدرج الكثافة عن طريق وضع طرف الماصة على مقربة من التدرج الكثافة ومن خلال تمكين خليط الدم لتشغيل أسفل الجانب من الأنبوب ببطء شديد. اعتمادا على حجم التجربة، طبقة 10 مل من خليط الدم على رأس 3 مل من درجة الكثافة (في أنبوب 15 مل) أو طبقة 35 مل من خليط الدم على رأس 15 مل من درجة الكثافة (في 50 مل أنبوب). عادة، 10 مل من الدم الكامل ينتج 10 ملايين PBMCs، مع بعض الاختلاف المانحة إلى الجهات المانحة. ملاحظة: من المهم جدا أن يكون هناك أي اختلاط الخليط الدم مع التدرج الكثافة. يجب أن طبقة الخليط الدم خلال التدرج كثافة وترتفع ببطء حتى كل الدم على أعلى درجة الكثافة. أجهزة الطرد المركزي الخليط الطبقات في 700 x ج لمدة 30 دقيقة دون فرامل. والطرد المركزييجب فصل خليط ifuged إلى 5 طبقات (من الأعلى إلى الأسفل): البلازما، ومعطف بافي (التي تحتوي على PBMCs)، كثافة المواد التدرج، المحببة، وكرات الدم الحمراء. إزالة والتخلص من غالبية البلازما واسترداد بعناية محتوى معطف الشهباء (PBMC) في أنبوب 15 مل جديد باستخدام ماصة باستور ولمبة الشفط. ملاحظة: إزالة طبقة معطف الشهباء يتم ذلك على نحو فعال من خلال تطبيق الشفط على ماصة باستور أثناء أداء حركة دائرية حول الجزء الخارجي من طبقة، مع غيض من ماصة ضد الأنبوب. غسل PBMCs معزولة ثلاث مرات في درجة الحموضة 7.3 الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) بواسطة الطرد المركزي في 350 x ج لمدة 10 دقيقة (مع الفرامل كاملة) بين يغسل. إعادة بيليه PBMC في المتوسط ​​RPMI كاملة. اعتمادا على حجم بيليه، 3-7 مل من المتوسط ​​غير كافية. عد PBMC باستخدام التريبان الأزرق وعدادة الكريات. الاعتماد فقط تلك الخلايا التي لم يتم الملون بالأزرق التريبان. Reconstitutه على PBMCs إلى 1،750،000 خلية / مل في المتوسط ​​RPMI كاملة. البذور 400 ميكرولتر (700،000 خلايا) في كل بئر من الشريحة 8 الغرفة. احتضان الشريحة في 37 درجة مئوية، ترطيب تماما نسيج الثقافة الحاضنة (تستكمل مع 5٪ CO 2) لمدة 1 ساعة للسماح للالوحيدات / الضامة على الانضمام. 2. المعالجة المسبقة للالالتزام وحيدات ملاحظة: هذه الخطوة الضرورية فقط إذا كنت تبحث عن سبل لمنع أو تعزيز البلعمة. انضمت قبل علاج حيدات مع أي دواء (ق) أو مركب (ق) من الفائدة. إعادة تشكيل المخدرات (ق) أو غيرها من المواد اختبار للتركيز المطلوب باستخدام المتوسطة RPMI كاملة. ملاحظة: على سبيل المثال، عادة ما تستخدم 200 ميكروغرام / مل من IVIG أن تسفر عن تثبيط 95-100٪ من البلعمة عند استخدام حيدات الإنسان. نضح وتجاهل طاف تحتوي على أي خلايا غير ملتصقة من الشريحة 8 الغرفة بعد حضانة 1-ساعة (بعد الخطوة 1.6). استبدله 400ميكرولتر من دواء أو علاج آخر واحتضان لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. عندما الشفط واستبدال الحلول في الشريحة 8 الغرفة، تأكد للسيطرة على تدفق السوائل بحيث خلايا الالتزام ضعيف لا يقلع. أيضا، والعمل مع فقط 2-3 الآبار فارغة في وقت وتجنب تجفيف الآبار. ملاحظة: عادة، يتم تنفيذ كل معاملة في يثلث التقنية. 3. طهاية من R 2 R 2 خلايا الدم الحمراء ملاحظة: R 2 R 2 المستخدمة هنا هي الحصول عليها من مركز جمع الدم (الكندية خدمات الدم)، وإنما هي أيضا متاحة تجاريا. تستخدم Opsonized R 2 R 2 كرات الدم الحمراء كما تحكم إيجابية لالبلعمة بوساطة FcγR. السذاجة R 2 R 2 يجب أن يتم تخزينها في حل Alsever في (لإطالة العمر الافتراضي) في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 1 في الشهر. يتم حل Alsever لفي المنزل ويتكون من 0.8٪ ث / ت سترات الصوديوم (ثنائي الهيدرات)، 1.9٪ ث / ت سكر العنب، 0.42٪ ث / ت كلوريد الصوديوم، و 0.05٪ ث / ت حمض الستريك (الهيدرات). إذا R 2 R 2 خلايا غير متوفرة، وغيرها من الخلايا phenotyped الصحة الإنجابية، مثل R 1 R 2، R 1 R 1، R 1 ص، أو R 2 ص، ويمكن استخدامها. غسل R 2 R 2 (الرفيق / الرفيق) خلايا الدم الحمراء في برنامج تلفزيوني ما مجموعه ثلاث مرات باستخدام الطرد المركزي في 350 x ج لمدة 5 دقائق لكل منهما. ملاحظة: كمية كرات الدم الحمراء اللازمة يعتمد على حجم التجريبية ويمكن أن يكون حساب العودة. غسل دائما كمية كبيرة من كرات الدم الحمراء، حيث يتم فقدان كرات الدم الحمراء خلال كل غسل بسبب تحلل أو أثناء إزالة طاف. على سبيل المثال، في تجربة مع 5 العلاجات و2 الضوابط، كل أجريت في يثلث التقنية، هناك ما مجموعه 21 بئرا. 21 بئرا مع 400 ميكرولتر / بئر 1.25٪ RBC الخليط إلى أن 105 ميكرولتر من معبأة، opsonized هناك حاجة إلى ربك. 200 ميكرولتر من RBC يجب غسلها في البداية و 150 & #يجب opsonized L لضمان وجود كمية كافية من كرات الدم الحمراء للخطوة البلعمة، 181. يستطهي غسلها R 2 R 2 بيليه مع 1: 1 ت / ت بولكلونل أضداد-D من مصل الدم البشري واحتضان لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية، مع الخلط على فترات متقطعة. ملاحظة: إذا بولكلونل أضداد-D غير متوفرة، فمن الممكن استخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة المضادة للD، وهي متوافرة تجاريا، أو مكافحة-D الذي يستخدم عادة لره الوقاية المناعي، والتي يمكن الحصول عليها من بنوك الدم أو نقل خدمات. وينبغي إجراء الاختبار الأمثل في البداية، عند إعداد مقايسة، وكلما تبديل الكثير من الأجسام المضادة، titered الامم المتحدة أو التحول إلى الأجسام المضادة وحيدة النسيلة. هذا هو تحديد تركيز الأمثل أو حجم المضادة للD المطلوبة لاختبار أضداد الغلوبولين (IAT) نتيجة بين 3+ و 4+ والبلعمة نتيجة بين 70-90 كرات الدم الحمراء المبتلعة في 100 حيدات فرزها. غسل يستطهيد R 2 R 2 ما مجموعه ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني باستخدام الطرد المركزي في 350 x ج لمدة 5 دقائق لكل منهما. ملاحظة: طهاية بنجاح R 2 R 2 ويمكن التأكد عن طريق إجراء IAT غير مباشر. لفترة وجيزة، وأضاف الأجسام المضادة الثانوية مكافحة الإنسان لربط الأجسام المضادة opsonizing الأولية على الأسطح RBC، وإشارة تضخيمها بحيث يمكن ملاحظتها في شكل التراص. ويمكن الاطلاع على بروتوكول الشركة المصنعة مفصل في ملف المواد التكميلية. إعادة غسلها R 2 R 2 بيليه إلى 1.25٪ ت / ت باستخدام المتوسطة RPMI كاملة. ملاحظة: الزائد R opsonized 2 R 2 يمكن تخزينها في حل Alsever لفي 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع. 4. البلعمة بوساطة مستقبلات-FC نضح المخدرات أو طاف المتوسط من الشريحة 8 الغرفة وإضافة 400 ميكرولتر من 1.25٪ ت / ت R 2 R 2 الخليط. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. الخلفإيه 2 ساعة من الحضانة، وإزالة الدوائر باستخدام محولات الشركة المصنعة. ربت قبالة الزائد R 2 R 2 على منشفة ورقية. تأكد من أن شريحة لا تجف. ملء كوب 100 مل مع برنامج تلفزيوني. غمر وغسل الشريحة التي تتحرك ببطء الشريحة ذهابا وإيابا (حوالي 30-40 السكتات الدماغية) لإزالة غالبية-المبتلعة الامم المتحدة R 2 R 2. إزالة الشريحة من برنامج تلفزيوني. ربت قبالة الزائد PBS باستخدام منشفة ورقية أو الأنسجة والهواء الجاف الشريحة. إصلاح الشريحة المجفف في الهواء في الميثانول بنسبة 100٪ لمدة 45 ثانية. ثم، والهواء الجاف الشريحة الثابتة. ملاحظة: يمكن ان تكون ثابتة الشرائح باستخدام طريقة أخرى التي هي أكثر توافقا لتلطيخ المصب، مثل وصمة عار جرونوالد بالغيمزا 21 أو وصمة عار رايت بالغيمزا 22. جبل الشريحة باستخدام في صنع منزل تصاعد elvanol المتوسطة (أو المتوسطة المتزايدة المتاحة تجاريا آخر) وإضافة coverslips. يتكون Elvanol المتوسطة المتزايدة من 15٪ ث / ت ص: ملاحظةlyvinyl الراتنج الكحول و 30٪ ت / ت الجلسرين في برنامج تلفزيوني. ويسخن المزيج حتى يذوب كل الراتنج والجليسرين مختلطة متجانس. يمكن استبدال هذا مع تصاعد المتوسط ​​الأخرى المتاحة تجاريا. السماح للجبل لتجف بين عشية وضحاها قبل الكمي. 5. الكمي من البلعمة باستخدام المجهر المرحلة على النقيض من و40X عدسة الهدف، تحديد يدويا كمية من الأحداث أكلة عن طريق العد لا يقل عن 200 حيدات وعدد من المبتلعة R 2 R 2 ضمن هذه حيدات. هل لديك عداد واحد في كل يد لتحديد وقت واحد وعدد من وحيدات وعدد من المبتلعة R 2 R 2. الحصول على متوسط مؤشر أكلة بقسمة عدد من المبتلعة R 2 R 2 من قبل عدد من وحيدات ضرب من قبل 100. اكسبريس البيانات كما المتوسط (متوسط مؤشر البلعمة) ± الخطأ المعياري للمتوسط (SEM). </li>

Representative Results

باتباع الخطوات الحاسمة في الشكل (1) والإجراءات الموضحة أعلاه، مجلس العمل المتحد لا يمكن أن يؤديها بتكاثر. وقد استخدم IVIG كمثال لتثبيط البلعمة في الشكل 2. ومن المعروف IVIG لربط ومنع المستقبلات التيسير، مما يحول دون نتائج المصب البلعمة. بواسطة المعايرة كمية IVIG المستخدمة، لوحظ تثبيط تعتمد على الجرعة، التي تركيزات أعلى من 200 ميكروغرام أسفرت / مل في ما يقرب من 100٪ تثبيط وتركيزات أقل من 0.5 ميكروغرام / مل لم تمنع على الإطلاق (الشكل 2A). عندما تتحول المؤشرات أكلة وتطبيع للمراقبة إيجابية R 2 R 2 ك 0٪ كبت، منحنى تثبيط مع IC 50 من 3 ميكروغرام يمكن تحديد / مل (الشكل 2B). بالإضافة إلى إجراء فحص على الدوام، quantificaنشوئها الفحص يمكن أن يكون صعبا في بعض الأحيان. الشكل (3) عبارة عن مجموعة من المرحلة على النقيض من الصور المجهري مختلف الشرائح MMA. مع خبرة المجهر، يمكن للمرء أن يميز الوحيدات من RBC تلوث (الشكل 3D)، أو فجوة من RBC المبتلعة (الشكل 3B). وينبغي تجنب التجمعات الكثيفة للخلايا و / أو الحطام خلال الكمي (أرقام 3E و F). أيضا، ينبغي للمرء تجنب الإفراط في opsonizing آر 2 R 2 RBC، التي من شأنها أن تؤدي إلى البلعمة الكبيرة التي يمكن overcrowds الداخلية الوحيدات ويتداخل مع التقدير الدقيق (الشكل 3C). الشكل 1. رسم تخطيطي من مجلس العمل المتحد. ووصف خطوة بخطوة من خطوات حاسمة في مجلس العمل المتحد: عزل PBMC من الدم الكامل، وإطعام monocyt الالتزاموفاق مع opsonized R 2 R 2، وغسل الشرائح غرفة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 2. الوريد مفتش (IVIG) يمنع البلعمة في المختبر باستخدام MMA. ومن المعروف IVIG لمنع البلعمة، ويستخدم كعنصر تحكم تثبيط في MMA البشري. (A) المعايرة من IVIG أدى إلى تثبيط تعتمد على الجرعة البلعمة بالمقارنة مع غير المعالجة R 2 R 2 السيطرة. وأظهرت النتائج أن متوسط ​​± الخطأ المعياري للمتوسط ​​(SEM) ن = 3 تجارب. وقد أجري التحليل الإحصائي باستخدام الطلاب ر -test: ** P≤0.01 و*** P≤0.001. (ب) منحنى تثبيط IVIG مع IC 50 سو 3 ميكروغرام / مل (الخط المنقط). وتشير نتائج البيانات تطبيع لR غير المعالجة 2 R 2 (0٪ تثبيط)؛ يعني ± SEM من ن = 3 تجارب. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 3. المرحلة على النقيض الصور المجهر الشرائح العينة تحت 40X التكبير. (A) الشريحة مثالية فيه حيدات المبتلعة 1-2 R 2 R 2 في المتوسط (السهام السوداء مع توهج هالة مميزة)، مع عدد قليل جدا من تلويث، برنامج الأمم المتحدة للالمبتلعة R 2 R 2 في الخلفية (السهام البيضاء). فجوات (B) كما هو مبين في هذه الشريحة، وحيدات في بعض الأحيان قد الموسع (السهام البيضاء)، والتي يمكن أن يكون مخطئا لالمبتلعة R 2 R 2. (C </ قوي>) عندما يكون R 2 R 2 الإفراط في opsonized، أكثر من 4-5 المبتلعة R 2 R 2 في الوحيدات (الأسهم السوداء) تجعل عد دقيقة صعبة، منذ R 2 R 2 تزدحم داخل الوحيدات وخلية متميزة لا يمكن تمييزها الحدود. (D) غسل عدم كفاية الشريحة يؤدي إلى وفرة R 2 R 2 تلوث (السهام البيضاء)، والتي يمكن أن يكون مخطئا لكرات الدم الحمراء الالتزام. (E) في بعض الأحيان، وحيدات وكرات الدم الحمراء تلويث قد شكل مجموعات. تشير مجموعات أيضا التلوث الجرثومي، والتي ينبغي تجنبها. (F) وحيدات قد تشكل المجاميع الكبيرة، التي يجب تجنبها أثناء الكمي. عن طريق اختيار عشوائي من الحقول لعرض، لوحة (أ) هو ما لوحظ عادة إذا كان قد تم إجراء MMA بشكل صحيح. شريط النطاق هو 20 ميكرون. الرجاء الضغط هنالعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

مجلس العمل المتحد هو أسلوب شاقة تتطلب الخبرة في كل من زراعة الأنسجة والفحص المجهري. هناك العديد من الخطوات الهامة لضمان النجاح: 1) جيل من أحادي الطبقة الوحيدات. 2) طهاية من كرات الدم الحمراء، و 3) الكمي اليدوي. لا تلتزم أحادي الطبقة الوحيدات بقوة إلى الشريحة الغرفة، لذلك يجب المحافظة على درجة الحموضة الفسيولوجية في جميع أنحاء فحص ^11، وينبغي أن المصنف وجود عدد كاف من PBMCs. pipetting لقوي، والتي قد تعكر صفو خلايا الالتزام، ينبغي تجنبها. نهج واحد هو إزالة دائما وإضافة حلول من نفس زاوية الغرفة والتأكد من أن الحركة بطيئة وثابتة. وبالمثل، خلال خطوة الغسيل الأخيرة لإزالة الزائد كرات الدم الحمراء، وينبغي أن تكون الحركة بطيئة وثابتة. وهذا يضمن الحد الأدنى من اضطراب أحادي الطبقة في حين لا يزال إزالة الغالبية العظمى من كرات الدم الحمراء-المبتلعة الامم المتحدة. وغسل غير كافية يؤدي إلى خلفية عالية من كرات الدم الحمراء الملوثة، الأمر الذي يجعل منه اليدويntification صعوبة. ثانيا، كرات الدم الحمراء R ₂ R ₂ يجب opsonized بما فيه الكفاية للحصول على متوسط مؤشر أكلة من 80-120 لمراقبة البلعمة. هذا النطاق أكلة المطلوب توازنا بين سهولة العد (على سبيل المثال، المبتلعة حيدات مع أكثر من 5 كرات الدم الحمراء يصعب تحديدها بدقة) والحفاظ على كمية كافية من البلعمة للتحليل الإحصائي. درجة طهاية يمكن تأكيد من قبل معهد التكنولوجيا التطبيقية، وهناك حاجة إلى القراءة بين 3+ 4+ ل. وR ₂ R يجب التخلص ₂ كرات الدم الحمراء عندما يكون هناك تحلل الزائد أثناء الغسيل، عندما يتحول طاف الأحمر الداكن، أو عندما لوحظ انخفاض كبير في البلعمة في التجارب نظرا لشيخوخة الخلايا في التخزين. وأخيرا، وتحديد يدوي باستخدام المجهر ويمكن أن تكون خادعة، وخاصة عند المقارنة بين التهم بين أفراد المختبر وبين التجارب. من خلال دراسة نفس المجال على كل بئر، أو ببساطة عن طريق عد المزيد من الخلايا، يمكن الحصول على عدد أكثر اتساقا. ويوصى التدريب جنبا إلى جنب مع فني من ذوي الخبرة واستخدام مجموعة معينة من الشرائح التدريب.

نقد كبير من مجلس العمل المتحد هو ذاتية الخطوة الكمي اليدوية. ومع ذلك، مع التدريب المناسب، والاتساق ويمكن الحصول عبر عدادات مختلفة. الحد الآخر هو الجوهرية الخلافات المانحة إلى الجهات المانحة في قدرات أكلة الوحيدات وفي R ₂ R ₂ سطح مستويات التعبير مستضد، والتي هي مصدر التباين في البيانات عند التعامل مع العينات البشرية.

تتوفر لدراسة البلعمة بوساطة FcγR تقنيات بديلة أخرى. غالبية مجموعات تجارية تستخدم الناتج الفلورسنت لمراقبة البلعمة (على سبيل المثال، bioparticles وحساسة درجة الحموضة البروتين مضان، أو المسمى مفتش الخرز اللاتكس الفلورية). استخدام الناتج الفلورسنت لا تقدم الكمي أكثر موضوعية، ولكن يحتاج واحد أيضا لخداعسدر توافر والتكلفة والتدريب المرتبطة باستخدام المجهر الفلورسنت أو قياس التدفق الخلوي، فضلا عن الاعتماد التي تلت ذلك على مجموعات المتاحة تجاريا.

وأخيرا، وهذا الفحص يمكن تعديلها تبعا لسؤال البحث. على سبيل المثال، عند اختبار تثبيط المخدرات البلعمة، وحيدات يمكن أن تكون إما قبل المعالجة أو المشارك حضنت مع كل من المخدرات وكرات الدم الحمراء opsonized (أي فحص المنافسة). إشارات المصب من الأجسام المضادة من أنواع فرعية مختلفة، والأجسام المضادة خيالية، أو يبني المؤتلف ويمكن أيضا اختبار. مع اختراقات الأخيرة في تطوير مستضد باطل العالمي الدم ^24، مجلس العمل المتحد يمكن استخدامها في الشاشات الأولية لهذه كرات الدم الحمراء مستضد لاغيا مع مختلف الأجسام المضادة لتقييم ما إذا كان هناك بالفعل فعالية خفضت في التسبب البلعمة.

Materials

Acid citrate dextrose (ACD) vacutainers	BD	REF364606
RPMI 1640	Sigma	R8758
HEPES	Bioshop	HEP003.100
Fetal bovine serum	Multicell	080150
Gentamicin	Gibco	15710-64
Ficoll-Paque PLUS	GE	17-1440-03	https://www.gelifesciences.com/
Phosphate buffered saline	Sigma	D8537
8-chamber slides	Lab-Tek-ll	154534
R2R2 (cDE/cDE) red blood cells	Canadian Blood Services		Commercially available (e.g. http://www.bio-rad.com/en-ca/product/reagent-red-blood-cells)
Polyclonal anti-D from human serum	Gamma Biologics	DIN 02247724	Can be substituted with commercially available monoclonal anti-D or with Rh immune globulin
100% methanol	Caledon	6700-1-42
Polyvinyl alcohol resin	Sigma	P8136	Can be substituted with commercially available mount
UltraPure glycerine	Invitrogen	15514-011
Cover slips	VWR	48366 067
Novaclone anti-IgG	Immucorgamma	5461023	Optional for IAT (http://www.fda.gov/downloads/biologicsbloodvaccines/…/ucm081743.pdf)