Détermination de l'échelle du génome de Timing de réplication mammalienne par l'ADN Mesure Contenu
Summary
We describe here a relatively fast and simple approach for mapping genome-wide mammalian replication timing, from cell isolation to the basic analysis of the sequencing results. A genomic map of a representative replication program will be provided following the protocol.
Abstract
La réplication du génome se produit pendant la phase S du cycle cellulaire dans un processus hautement régulé qui assure la fidélité de la duplication de l'ADN. Chaque région génomique est répliqué à un moment distinct lors de la phase S par l'activation simultanée de multiples origines de réplication. Temps de réplication (TDR) est en corrélation avec de nombreuses caractéristiques génomiques et épigénétiques et est liée à des taux de mutation et le cancer. Comprendre la vue complète du génome du programme de réplication, de la santé et de la maladie est un objectif de l'avenir et un défi.
Cet article décrit en détail le "Rapport de copie Nombre de S / G1 pour la cartographie Temps génomique de réplication" méthode (appelée ici: CNR-TdR), une approche simple pour cartographier le génome large TdR de cellules de mammifères. La méthode est basée sur les différences de nombre de copies entre les cellules en phase S et les cellules en phase G1. La méthode CNR-TdR est effectué en 6 étapes: 1. Préparation des cellules et la coloration avec l'iodure de propidium (PI); 2. Sørting G1 et des cellules en phase S à l'aide de cellules activées par fluorescence (FACS); 3. purification d'ADN; 4. sonication; 5. préparation et séquençage Bibliothèque; et 6. L'analyse bioinformatique. La méthode CNR-TdR est une approche simple et rapide qui se traduit par des cartes de réplication détaillées.
Introduction
la réplication de l'ADN de mammifère est étroitement régulée pour garantir la réplication précise de chaque chromosome exactement une fois au cours du cycle cellulaire. La réplication se produit selon un ordre très réglementé – plusieurs grandes régions génomiques (~ Mb) répliquent au début de la phase S (réplication précoce des domaines) , tandis que d' autres régions génomiques reproduisent plus tard , au milieu ou en phase S tardive (milieu et fin répliquant les domaines) 1. La majeure partie du génome réplicats en même temps dans tous les tissus (domaines TdR constitutifs), tandis que 30% – 50% du génome, change TdR entre les tissus 2, au cours de la différenciation 3, 4 et , dans une moindre mesure , au cours de la transformation cancéreuse 5 . Par ailleurs, certaines régions génomiques se répliquent de manière asynchrone 6, 7, 8, à savoir il y a une différencedans les TdR entre les deux allèles.
TdR est en corrélation avec de nombreuses caractéristiques génomiques et épigénomiques y compris les niveaux de transcription, le contenu GC, l' état de la chromatine, la densité de gènes, etc. 1, 9. TdR est également associée à des taux et des types 10, 11 et donc sans surprise la mutation, des perturbations du programme de réplication sont liés au cancer 12, 13. La relation de cause à effet entre les TdR et la structure de la chromatine est pas encore compris. Il est possible que la chromatine ouverte facilite la réplication précoce. Cependant, un autre modèle suggère que la chromatine est assemblé lors de la réplication et les différents régulateurs de chromatine présents au début et à la fin de la phase S conduisent à différentiel emballage des régions de réplication précoce et tardive 1, 14 </sup>. Nous avons récemment montré que le TdR façonne la teneur en GC en affectant le type de mutations qui se produisent dans différentes régions du génome 11.
Fluorescence hybridation in situ (FISH) est la principale méthode de mesure TDR à des loci particuliers. Elle est réalisée simplement en comptant le pourcentage de cellules en phase S qui présentent des signaux de poissons isolés par rapport au pourcentage de doublets pour un allèle donné 15, 16. Une autre méthode est constitué d'impulsions marquage de l'ADN avec du BrdU, le tri des cellules en fonction de leur teneur en ADN à plusieurs points temporels le long de S, immunoprécipitation ADN contenant BrdU, et la vérification de l'abondance de l' ADN précipité avec 17 qPCR.
TdR cartographie génomique peut être réalisée par deux méthodes. La première méthode est une version génomique de la méthode basée sur la BrdU IP décrite ci-dessus, dans lequel la quantification de la quantitéde l'ADN précipité dans chaque fraction est effectuée simultanément pour l'ensemble du génome par hybridation à microarrays ou par séquençage profond. La deuxième méthode, CNR-TdR, est basé sur la mesure du nombre de copies de chaque région génomique de cellules en phase S et en normalisant par la teneur en ADN dans les cellules G1. Dans cette méthode, les cellules sont triées par FACS dans la non-répliquant (phase G1) et la reproduction (phase S) des groupes (figure 1). Les cellules en G1 ont le même nombre de copies dans toutes les régions du génome et par conséquent leur teneur en ADN devraient être les mêmes. D'autre part, le nombre de copies d'ADN dans S dépend de la TdR, puisque les régions de réplication premières ont subi la réplication dans la plupart des cellules et donc leur teneur en ADN est doublé, tandis que les régions de réplication en retard ne sont pas encore repris dans la plupart des cellules et donc leur teneur en ADN similaire à celui des cellules G1. D'où le rapport S G1 du contenu ADN est indicatif du TdR. La quantité d'ADN pour chaque région génomique est mesurée soit par hybridation àmicroarrays ou par séquençage profond 2, 8. Les avantages de la méthode CNR-TdR seront discutés.
Le présent document décrit la méthode CNR-TdR pour la cartographie génomique TdR comme décrit dans la figure 2. Le document traite des détails fins de l'ensemble du processus de collecte de cellules jusqu'à ce que l'analyse de base des résultats et la création de cartes TdR génomiques. Le protocole décrit dans le présent document a été réalisé avec succès sur différents types de cellules en culture. Les améliorations futures de ce protocole peuvent conduire à la cartographie des TdR in vivo et dans des types cellulaires rares.
Protocol
Representative Results
Discussion
CNR-TdR peut être effectuée , en principe , sur une population de cellules proliférantes eucaryote qui peut être divisé par FACS à S et les phases G1 (examinées par Rhind N. et Gilbert 20 DM). La méthode décrite ici a été ajusté pour les cellules de mammifères avec une taille de génome de ~ 3 Gb tels que l'homme et la souris. De petits changements dans le protocole CNR-TdR (en préparation cellulaire et de la profondeur de séquençage) sont nécessaires, afin de l'adapter ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Oriya Vardi pour l'aide à générer des chiffres. Le travail dans le groupe IS a été soutenu par la Fondation Israël Science (subvention n ° 567/10 du) et le Conseil européen de la recherche Starting Grant (# 281306).
Materials
| PBS | BI (Biological Industries) | 02-023-1A |
| Trypsin-EDTA | BI (Biological Industries) | 03-052-1B |
| 15ml conical tube | Corning | 430790 |
| 5ml Polystyrene round Bottom tube with cell strainer cap | BD-Falcon | 352235 |
| Ethanol | Gadot | 64-17-5 |
| RNAse-A 10mg/ml | Sigma | R4875 |
| Propidiom iodide 1mg/ml | Sigma | P4170 |
| parafilm | Parafilm | PM-996 |
| 1.5ml DNA LoBind Eppendorf tubes | Eppendorf | 22431021 |
| BSA | Sigma | A7906 |
| 1.7ml MaxyClear tube | Axygen | MCT-175-C |
| magnetic beads – Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 |
| Ultrasonicator | Covaris | M-series -530092 |
| 50 µl microTUBE AFA Fiber Screw-Cap 6x16mm | Covaris | 520096 |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | |
| Qubit dsDNA High Sensitivity (HS) Assay Kit | Invitrogen | Q32854 |
| Electrophoresis.2200 Tape station system | Agilent | D1000 ScreenTape |
| Seqeuncing – Illumina NextSeq system | Illumina | SY-415-1001 |
| Dneasy kit for DNA purification | Qiagen | 69504 |
| PureProteom Magnetic Stand | Millipore | LSKMAGS08 |
| Anti-BrdU/FITC | DAKO | F7210 |
| FACS sorter | BD | FACSARIA III |
| FACS software | BD | FACSDiva v 8.0.1 |
Referências
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