Summary
Este estudio implica métodos para revelar efectos en un modelo de acogida pescado siguientes alteración de la piel y el intestino comunidades microbioma composición por un antibiótico.
Introduction
Se ha establecido que los antibióticos pueden alterar el microbioma humano que lleva a la disbiosis, lo que significa un desequilibrio comunidad microbiana. Alteración de la composición de la microbiota después de tratamientos con antibióticos se ha demostrado que disminuye la diversidad de la comunidad, reducir los miembros clave, y alterar el metabolismo de la comunidad, especialmente en el intestino 1, 2. Perturbación antibiótico de la microbioma intestinal puede reducir la resistencia a la colonización de Clostridium difficile 3, 4 y 5 de Salmonella.
Además, la interrupción de la microbiota se ha relacionado con el desarrollo de muchos síndromes y enfermedades en los seres humanos (por ejemplo, asociada a antibióticos enterocolitis, enfermedad inflamatoria del intestino, trastornos metabólicos, etc.). Los antibióticos también se aplican ampliamente en la agricultura como promotores del crecimiento enganado y aves de producción 6. El uso de estas herramientas de gran alcance no está exenta de efectos colaterales, lo cual es evidente en el rápido aumento de la resistencia a los antibióticos, así como los efectos de un microbioma perturbado tiene con su huésped habitado. Muchos estudios han demostrado que el amplio espectro uso de antibióticos tiene consecuencias de largo duraderas a la estructura y función de la microbiota, sin embargo, los efectos secundarios de un microbioma afectar la fisiología de acogida a los antibióticos alterado son sólo especulaciones que aún tienen que ser apoyados.
La interacción entre el huésped, la microbiota y antibióticos está lejos de ser entendido de una manera concisa. Por lo tanto, un modelo sencillo y más manejable es ventajoso para arrojar luz sobre el sistema de mamíferos de gran complejidad. las superficies mucosas de los seres humanos, incluyendo el intestino, albergan la mayor densidad y diversidad de microbios, y también los más íntimos interacciones microbio-huésped. El microbioma de la piel de la mucosa de las ofertas de pescado several ventajas como un sistema modelo. El teleósteos (peces óseos) es uno de los más antiguos linajes a divergir, en el sentido de que los teleósteos vertebrados tienen tanto innata y adquirida sistemas inmunológicos que han co-evolucionado una relación con las comunidades bacterianas comensales 7. Acciones piel de pescado muchas características con las superficies de tipo 1 de la mucosa de mamíferos, tales como las funciones fisiológicas, componentes de inmunidad, y la disposición de las células productoras de moco 8. La ubicación externa de la superficie de la mucosa de la piel de pescado ofrece un microbioma fácil de manipular experimentalmente y se muestra.
El mosquito, Gambusia affinis (G. affinis), es un pez de modelo que se ha utilizado en el pasado para el estudio de acoplamiento y toxicología 9, 10, 11. Dado el pequeño tamaño, abundancia de la población en la naturaleza como una especie invasora, m los costos de atención inimal, y la naturaleza robusta, hemos desarrollado G. affinis como modelo microbioma de la mucosa. Además, Gambusia comparten la fisiología de dar a luz a crías vivas con los mamíferos vivíparos, que es poco común en las especies de peces. Hemos completado el estudio más amplio en el momento de piel de pescado microbiota normal usando 16S perfiladora de Gambusia 12. Posteriores demostraron tres efectos negativos sobre el anfitrión siguientes alteración de la piel y el intestino microbiota usando un antibiótico de amplio espectro 13.
Cinco efectos diferentes se examinaron en los peces después de la exposición a los antibióticos. El beneficio anfitrión más bien establecida del microbioma es la exclusión competitiva de patógenos. El patógeno de peces Edwardsiella ictaluri es conocido por causar brotes de septicemia entérica en granjas comerciales de bagre 14. E. ictaluri también se ha demostrado para infectar letalmente pez cebraclass = "xref"> 15, 16 y 17 Gambusia. Un desafío con este patógeno de la columna de agua puede servir como una medida de la exclusión. Como comparación a la susceptibilidad a un patógeno individual, la supervivencia durante la exposición a una alta densidad de organismos mixtos también se llevó a cabo. Las heces y el suelo rico en materia orgánica se utilizaron como fuentes encontradas comúnmente de las comunidades microbianas.
Otra función establecida la comunidad bacteriana intestinal es realiza el procesamiento de nutrientes y la energía de la cosecha, lo que afecta a la absorción nutricional general para el anfitrión. Como una medición bruta de la nutrición, el peso corporal de pescado se comparó antes y después de un mes de ser alimentados con una dieta estándar. pescado tratado con antibióticos como un promedio perdieron peso mientras que los peces de control en promedio aumentó de peso durante el mes. El mecanismo de esta falta de aumento de peso no está claro. Un posible factor que contribuye es el tiempo de tránsito de los alimentos en el intestino. Un moti GIdad método fue adaptado de pez cebra (Adam Rich, SUNY Brockport, comunicación personal) para determinar el tiempo de tránsito. Aún no se ha determinado si los peces tratados con antibióticos tienen un tiempo de tránsito alterada.
Un desafío común experimentado en el medio natural por todos los organismos, especialmente el pescado, es el estrés osmótico. Gambusia se ha demostrado que adaptarse rápidamente cuando está estresado de forma aguda en altas concentraciones de salinidad 18. Sorprendentemente, los peces con un microbioma antibióticos alterado exhibido redujo la supervivencia a una tensión elevada de sal. El mecanismo para este nuevo fenotipo está bajo investigación. Otra estrés común en animales acuáticos, especialmente en acuarios, es formas tóxicas de nitrógeno (amoníaco, nitrato, nitrito y). Survival contra nitrato no fue significativamente diferente entre los peces tratados con antibióticos y control. Los métodos presentados en este manuscrito se pueden utilizar con Gambusia o modelo de pescado similares organismos, tales como cebrapescado y medaka, para medir fenotipos en los peces después de la manipulación experimental.
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Protocol
Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo bajo la aprobación de protocolos IACUC, contados 14-05-05-1018-3-01, 13-04-29-1018-3-01, y 14-04-17-1018-3-01.
1. Recogida de Animales, manejo y cuidado ético
- Recoger Gambusiaaffinis desde el sitio de campo (guía de identificación en http://www.sms.si.edu/irlspec/Gambusia_affinis.htm) utilizando una pequeña red de inmersión y el lugar en 19 cubos L. Utilice la inspección visual para identificar las especies.
- peces descanso para 1 - 2 d en un cubo con agua del estanque. A continuación, transferir el pescado en 76 o 189 tanques L acuarios llenos de agua el agua del grifo mitad estanque / medio a 25 ° C, aireadas con una piedra de aire burbujeante. Use una pequeña red de inmersión durante la manipulación de pescado que no se perturbe mínimamente su microbioma de la piel.
NOTA: la densidad de peces no debe ser superior a 20 peces / 38 litros de agua del acuario. Los peces se aclimataron al acuario durante al menos 5 d antes de la experimentación. - Alimentar a los peces en un régimen diario con 5 mg de alimento de la escama por pez. Hold peces con un / 12 h oscuridad ciclo de 12 h de luz.
2. La exposición inicial con antibióticos para todos los experimentos
- Dibujo Todos los peces de cada experimento desde el mismo acuario, colocar en dos grupos separados (tratado: expuestos a los antibióticos y el control: no expuesta) en 19 cubos L. Los datos previos recogidos muestran que los peces en el mismo acuario han homogeneizado microbioma de la piel que tienen poca variación en la composición de la comunidad. 12
- Durante los experimentos, mantener a los peces en 2 l de agua del estanque artificial (APW; 0,33 g / l de CaCl2, 0,33 g / l MgSO4, 0,19 g / l de NaHCO3) que se esteriliza en autoclave antes de su uso.
- Preparar la solución de antibiótico rifampicina mediante la adición de 50 mg / ml en sulfóxido de dimetilo (DMSO). La rifampicina es un antibiótico de representante de amplio espectro que es no tóxico para los peces. En los seres humanos y los ratones, se distribuye bien en los tejidos.
- De la población de rifampicina administrar una finalconcentración de 25 mg / ml en 2 L de APW para exposición a los antibióticos del grupo de peces tratados durante 3 días. Tenga en cuenta que después de 3 d, la piel cultivables número de bacterias vuelven similar a la de piel de pescado tratado previamente.
- En paralelo, mantener un grupo de peces no tratadas en APW y dar una cantidad equivalente de DMSO (0,5 ml por L de APW) en la columna de agua para actuar como un grupo de control.
- Como experimentos están destinados a medir los efectos de un microbioma antibióticos alterado en fenotipos de pescado, con el fin de evitar los efectos directamente desde el propio antibiótico, tras la exposición de tres días de antibióticos (o control) período, pescado transferencia en un cubo con 2 L de APW fresco.
- Use un período de descanso de 10 horas por lo que el antibiótico se elimina por los cuerpos de los peces. Base este tiempo de eliminación en experimentos donde los peces fueron expuestos a 25 mg / ml de antibiótico durante tres días. La eutanasia a los peces cortando con tijeras la médula espinal seguido de descabello, a continuación, homogeneizar todo el cuerpo utilizando un triturador de tejidos.
- Determinar la presencia de antibióticos mediante la colocación de 50 l de esta suspensión después de 0,2 micras de filtrado en el centro de una placa de Petri agar. Hacer un agujero para esta suspensión pulsando un revés de la punta de la pipeta 200 l estéril en el agar, que absorbe un pequeño tapón.
- Usar placas de agar con 20 ml volumen medido de agar nutriente, y se extendió uniformemente usando un hisopo de algodón con un organismo indicador, Bacillus subtilis, que es sensible a la rifampicina. Obtener el B. subtilis de un agar nutritivo se incubaron a 25 ° CO / N y con un hisopo de algodón para obtener una colonia. La observación de una zona de inhibición después de la incubación durante la noche a 25 ° C indica la presencia de antibióticos en los tejidos de los peces.
3. Extracción de Microbiome
- Extraer una muestra microbioma piel de la epidermis de las mucosas exteriores mediante la colocación de los peces en un tubo estéril cónico de 15 ml llena con 2 ml de PBST estéril (Na 137 mMCl, fosfato 10 mM, 0,1% de Tween-20, pH 7,4) y solución de agitación en vórtex a un ajuste de 10 durante 1 min con 10 s incrementos de pausa. El detergente y la sal en el tampón promueve incluso la dispersión de bacterias en solución. Resultados comparables se encontraron con solución salina al 0,85% pero bajan los recuentos bacterianos con agua pura.
- Transferir el pescado del tubo cónico a un cubo de recuperación. La letalidad de la extracción de la piel suele ser inferior al 10%. O bien, analizar la suspensión bacteriana en el tubo inmediatamente después de la extracción o sedimentar las bacterias de un centrifugado de 2 minutos en una centrífuga a temperatura ambiente a 15.000 xg y se almacena a -80 ° C para su posterior análisis.
NOTA: Toda la cultura y los análisis bioquímicos son inmediatos; ADN o la extracción de proteínas pueden ser de las muestras congeladas. - Para obtener una muestra microbioma intestinal, en primer lugar el pescado en una placa de Petri estéril. La eutanasia a los peces mediante corte de la médula espinal cervical directamente detrás de la cabeza con unas tijeras quirúrgicas, seguido de descabelloY, a continuación desinfectar externamente el cuerpo con 70% de etanol toallitas.
- Después de la disección, eliminar todo el intestino por el corte después de la esófago y antes del ano.
- Cortar el intestino en pequeñas secciones de 1 - 2 mm de longitud y colocar todas las secciones en dos ml de solución de PBST en un tubo cónico. Después de agitación durante 1 min, eliminar el sobrenadante a otro tubo limpio (tomar la precaución de no elaborar las secciones intestinales).
NOTA: El sobrenadante contiene las bacterias intestinales extraídos que, o bien se pueden utilizar para los análisis directos o sedimentaron por el método anterior mencionado para muestras de piel.
4. Modelo de infección Preparación y Baño de un patógeno específico
- Obtener una cepa infecciosa de Edwardsiella ictaluri (E. ictaluri) y mantener la cultura se almacena a -80 ° C. La cepa 93 - 146 utilizada en este estudio, aislado de un pez gato infectado, se obtuvo de Mark Lawrence, Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad Estatal de Mississippi.
- Streak E. ictaluri social en un selectivos y diferenciales medios llamados medios de E. ictaluri (EIM) de agar de 19 a cultivar las bacterias e incubar durante 2 días a 27 ° C.
- Transferir una colonia aislada pura a partir del cultivo e inocular un matraz de 150 ml que contenía 40 ml de caldo nutriente (NB; 5 g / L de peptona, 4 g / L de extracto de carne). Colocar el frasco en un agitador ajustado a 150 rpm durante 2 días a 27 ° C.
- Después de la incubación, se diluye una muestra de la cultura en PBST a una lectura espectrómetro de 0,2 OD a 650 nm para calibrar cultivo de E. ictaluri para volúmenes de dosis infecciosas deseados.
- Siguiente transferencia tanto tratados (después de 3 días de exposición a antibióticos) y grupos de peces no tratados en las tazas de plástico individuales que contienen 130 ml de agua fresca estanque artificial, o APW comprende alrededor de 10 h para la eliminación del fármaco a partir de tejidos de peces.
- Luego de ambos grupos, transferir de nuevo cada pez a botes de plástico de 8 onzas que contienen 130 ml de APW limpia. Dé a cada pescado que contiene una dosis letal de 2,8 x 10 6 UFC / ml de cultivo de E. ictaluri en el APW (baño modelo de infección) y guardar en un 27 ° C incubadora durante 24 h.
- Después del baño ictaluri E., la transferencia de peces de forma individual en nuevos vasos con 130 ml de APW.
- Después de la sustitución del agua, ficha mortalidad de los peces durante la duración de una semana. Los peces no se alimentan durante este período. En contraste con el pez gato, Gambusia no muestran signos externos de infección, por lo tanto, es esencial usar la letalidad como criterio de valoración experimental.
5. polimicrobiana Challenge con las heces y del suelo
- Tratamiento de las heces
- Obtener heces humanas frescas de un sujeto voluntario sano que no ha recibido antibióticos en las dos semanas anteriores, el uso de guantes estériles y un tubo cónico estéril de 50 ml.
- Tras la recogida, recoger la materia fecal en una bolsa de plástico estéril y luego transferir a una estéril de 15 ml conical tubo. Crear una concentración de stock de la suspensión de heces con PBST hasta alcanzar una solución madre de 500 - 800 mg / ml. Esta mezcla espesa es la mejor manera de transferir un archivo con un 1 ml o punta de pipeta de plástico más grande que se ha cortado en la parte inferior con unas tijeras estériles para que la abertura es mayor.
- Después de la exposición a antibióticos inicial de grupos de peces no tratados tratados y de control, separar en vasos de plástico individuales que contienen la suspensión fecal a concentraciones finales de o bien 15 mg / ml o 10 mg / mL en APW con un volumen total de 130 mL. Almacenar vasos en una incubadora a 25 ° C.
- Registro de mortalidad de los peces durante la exposición fecal por una estrecha observación durante 2 d.
- Tratamiento de suelos
- Recoge 1 - 2 kg de tierra vegetal rica orgánica (debe contener la mayor densidad y diversidad de microbios) de aproximadamente 7 - 15 cm en profundidad y colocar en un recipiente de plástico limpio. Tenga en cuenta que el suelo debe ser utilizado dentro de los dos días consecutivos a la toma.
- Terriblectly después de período de exposición inicial, separar los dos grupos de antibiótico tratado y el pescado sin tratar en vasos de plástico individuales que contienen 18,2 g de suelo en 130 ml de APW. Mezclar el suelo en el pozo de agua con la mano antes de añadir el pescado. La mayor parte de las partículas no suspenden y se quedan en el fondo de la copa.
- Exponer a los peces con una duración de 3 días a 25 ° C y grabar cualquier mortalidad.
6. Desafío estrés osmótico
- Después del tratamiento, seguido de un período de descanso de 10 h como se describió anteriormente, individualizar los peces en las tazas separados que contienen NaCl a 17,5 mg / ml (300 mM) en 150 ml de APW. Este es un medio de la salinidad del agua de mar típica, que no es completamente letal (<50%) para el control de los peces, pero es fuertemente estresante, lo que requiere la osmorregulación eficaz.
- Observar si se produce la mortalidad de peces sobre una duración de 36 h.
7. Toxicidad del nitrato Challenge
- pescado debe descansar por un período de 10 horas después de exposiciones a los antibióticosUre, y el pescado, entonces separada en copas individuales que contienen una concentración de nitrato de sodio de cualquiera de 10 mg / ml (118 mM) o 17,5 mg / ml (206 mM) en 130 ml de APW.
- Registro de mortalidad durante 4 d de dosis baja y 1 d para alta dosis.
8. Análisis de crecimiento de los peces individualizada o agrupada
- Completado 3 d exposición a antibióticos o control periodo como grupos en cubos.
- Para individual, llenar de 8 onzas vasos de plástico con 150 ml cada APW, transferir un pez determinado en la taza y registrar el peso corporal total para la evaluación inicial.
- Repita este procedimiento para todos los peces en ambos grupos tratados y no tratados. Use vasos de plástico blanco en lugar de vasos de plástico claras porque los peces no va a comer cuando en los vasos transparentes.
- Alimentar a los peces todos los días con la dieta estándar de dos gránulos por los peces. Los sedimentos se utiliza en lugar de escamas debido pelets tienen una baja varianza en la masa individuo (3,53 ± 0,42 mg cada una, o% de variación 8), resulting en el pescado recibir cantidades similares de alimentos. Controlar el consumo mediante el registro visual gránulos sin comer. Las tasas de consumo eran por lo general por encima del 80%.
- Al final de cada semana durante 4 semanas, determinar el peso de pescado. Preparar una nueva taza con APW fresca, colocar en una balanza, y luego registrar el peso. A continuación, se vierte un pez en una red de inmersión de la copa original y transferir a la nueva taza, que luego se pesa de nuevo. Los peces no son manejados para evitar el estrés.
- Para grupos, colocar 2 l de APW en un cubo de 19 L y tarar la balanza. Mantener a los peces juntos en ambos grupos cuando se transfieren a nuevos cubos APW a continuación, registrar el peso total del grupo. Registro de peso grupo de pescado a la semana durante un período de tiempo mes mediante la transferencia a un nuevo cubo.
9. El tiempo de tránsito intestinal
- Utilice 70 kDa dextrano aniónica marcada con fluoresceína. El dextrano no se digiere de manera significativa, y es demasiado grande para ser absorbido a través de la capa de intestino, así el paso medirá el tiempo de tránsito a través del intestino.dextrano marcado se incorpora en alimento para peces.
- En un tubo estéril de 1,7 ml, añadir 360 l de agua desionizada estéril y 52 mg de gelatina (solución al 13%), y colocar el tubo en un bloque de calor a 60 ° C hasta que se derrita la gelatina y se haya disuelto completamente.
- Moler las escamas de peces de colores de alimentos a un polvo fino utilizando un mortero y una mano de mortero, y añadir 40 mg de este polvo al tubo, junto con 20 l de aceite de pescado. Después de mezclar, añadir 1,6 mg de FITC-dextrano.
- Dispensar la mezcla de líquido caliente en 20 l cae sobre Parafilm sobre la mesa de laboratorio, y dejar que se enfríe y solidifique rápidamente. Las gotas se pueden almacenar durante un máximo de 4 d antes de que sean demasiado difícil para los peces para comer. Tienda gotas en el refrigerador colocando el Parafilm en medio de una placa de Petri, que se flotó a continuación en agua estéril dentro de un contenedor de plástico sellado, lo que mantiene las gotas humidificado.
- Justo antes de la alimentación, trimestre cae en secciones usando una hoja de afeitar. Aclimatarse a los peces a la Styrovasos de espuma de forma individual para 2 días sin alimentación (Nota: sólo se utilizaron los peces de control no expuestos). Coloque cuatro cuartas partes de la comida en la taza con el pescado, y observar los peces durante 30 minutos para indicar la cantidad de piezas de los alimentos que comen cada uno.
- Para comenzar el período de seguimiento, transferir los peces de forma individual en las tazas con 80 ml de APW utilizando una red de inmersión. Cada 2 horas, remover suavemente el APW a mano, y luego tomar una muestra y tienda de 1 ml en un tubo etiquetado 1,7 ml a 4 ° C. Tomar muestras durante 36 h.
- fluorescencia Record, con una espectrofotómetro de fluorescencia, de todas las muestras al mismo tiempo después de la finalización del ensayo. Coloque el entero 1 ml de muestra en una cubeta, y registrar la fluorescencia medida usando excitación a 495 nm y emisión a 520 nm.
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Representative Results
Un diagrama esquemático general del sistema experimental usado para estudiar los efectos de acogida de pescado de la exposición a antibióticos 13 está representado en la figura 1A, e incluye la técnica para la extracción de la piel (Figura 1B) y el intestino (Figura 1C) microbiomas de los peces. Tres días fue seleccionado como el período de antibióticos de la exposición anterior, porque los datos revela que mientras que la piel cultivables número total de gotas al principio del tratamiento, que ha regresado a los niveles previos al tratamiento después de 3 d. Mientras tanto, la composición de la comunidad, según lo determinado por 16S perfilado, ha sido fuertemente alterado. Por lo tanto, el período de 3 días debe ser óptima para el análisis de los efectos de una comunidad cambiada de aproximadamente la misma densidad. Tenga en cuenta que el análisis de cultivo, con el número de colonias en placas de agar, puede dejar un número de especies. Eficiencia del método de dispersión microbioma piel (Figura 1B 4 10 hasta 05 10 CFU / g de peso de pescado) para el número de colonias de varios peces sometidas al mismo procedimiento de suspensión en un segundo tiempo (para cuantificar cualquier restante bacterias). Counts de esta segunda suspensión fueron inferiores a 100 UFC / g, lo que sugiere el método de suspensión es eficaz (no publicado).
Fish con un microbioma alterado-antibiótico parece ser más susceptible a una infección ictaluri E. que los peces de control (Figura 2). La diferencia en el tiempo medio hasta la muerte de 56,1 ± 15 h para los peces tratados y 98,5 ± 48 h para los peces de control no fue estadísticamente significativa (prueba t de Student, p = 0.12 dos colas). Esto es probablemente debido al tamaño pequeño grupo (tratados con n = 6, control n = 5). Por lo tanto, se recomienda el tamaño de los grupos de al menos una docena. Una ventaja de este modelo de infección es la bprotocolo ath, que no requiere agujas para la infección o el seguimiento de la ingesta de alimentos. E. ictaluri invade de forma natural siluro de la columna de agua. La seguridad es alta debido a E. ictaluri es sensible a la temperatura, y por lo tanto mal infeccioso para los humanos. Otros estudios han puesto de manifiesto que el tiempo hasta la muerte en G. affinis se correlaciona con la dosis inicial de bacterias. La temperatura de incubación de 27 ° C fue seleccionado como óptimo para las dos bacterias y peces.
Tratada o peces de control no tienen diferencias significativas en la supervivencia en agua contaminada con altos cargos de los microbios encontrados. No se observó una mortalidad de más de 4 días en el control (n = 8) o tratados (n = 9) de pescado cuando el suelo se utilizó como fuente microbiana. Mientras que algunos mortalidad sí ocurrió con heces humanas como la fuente de microbios (Tabla 1), el tratamiento con antibióticos no hizo ninguna diferencia. Cuando la concentración de las heces en APW estaba en 20 mg / ml, 40 - 50%del pez muerto. Sin embargo, la concentración de oxígeno disuelto era de sólo el 10% (en comparación con> 80% en cubos o acuarios), por lo que las condiciones de hipoxia confunden la interpretación. Cuando / se utilizaron niveles más bajos de 16 o 10 mg ml, las tasas de supervivencia fueron emparejados (dos caras prueba exacta de Fisher, p = 0,95 o superior, para una diferencia entre grupos). niveles de oxígeno disuelto en estos dos ensayos fueron del 65% o superior. Gambusia son especies invasoras muy resistentes que pueden vivir en agua de baja calidad. Sería interesante utilizar estos ensayos de exposición microbiana natural para medir la supervivencia de otras especies contra un desafío de agua contaminada. Las muestras de agua de los sitios ambientales específicos, especialmente aquellos sometidos a la eutrofización, podría ser utilizado en un ensayo similar, aunque la calidad del agua (O 2 disuelto, nitrato, salinidad, etc.) Tendrían que ser determinadas, como un factor de confusión potencial.
Fish eXposed a la rifampicina fueron más susceptibles al estrés osmótico que los peces de control (Figura 3). La prueba de log-rank observó una diferencia significativa (p = 0,049) en la tasa de supervivencia (43% de muerte en el grupo de control y 88% de muerte en el grupo tratado, n = 9 para ambos grupos) cuando fueron estimulados con salinidad elevada. Los resultados de este ensayo de acuerdo con una determinación de 18,1 mg / ml como la LC 50 para NaCl con G. affinis a las 24 h en agua dulce 20. Los signos de estrés salino que exhiben peces incluyen el enrojecimiento alrededor de las branquias y la disminución de movimiento de la natación. Con este ensayo, los niveles de salinidad por encima de 18 mg / ml dio lugar a una rápida muerte de peces.
Cuando se expone a nitrato de toxina en la columna de agua, pre-exposición a antibióticos no afectó a la supervivencia (Tabla 2). Para cada ensayo, la muerte se registró a la vez un punto de tiempo cortos y largos, que representa los efectos agudos y crónicos más. La concentraciónde 10 mg / ml se selecciona en función de que sea el LD 50 para G. affinis en agua dulce a 48 h 21. Los resultados de este ensayo fueron consistentes con este valor LD 50, con una letalidad del 50% en ambos grupos tratados y de control después de 90 h. Un mayor reto de nitrato se examinó también (17,5 mg / ml), que conduce a la muerte más rápida. Una vez más no hubo diferencia en los grupos de tratamiento. El nitrito es dramáticamente más tóxico que el nitrato a G. affinis, con una LD 50 de 0,0015 mg / mL a las 48 h 22. análisis bioquímico Comunidad utilizando el sistema de índice del perfil analítico (no publicado) muestra que la microbiota de piel de pescado tiene el potencial de reducir el nitrato. Sin embargo, los niveles de nitrito en el APW durante ambos ensayos se mantuvieron por debajo del límite de detección (0,001 mg / ml). Este método de desafío podría ser utilizado con cualquier pequeños productos químicos solubles.
Cuando individualizada en tazas y t Fedél misma cantidad a cada pez durante un mes, se observó una tendencia para los peces tratados con antibióticos para no aumentar de peso, así como peces de control, sin una diferencia estadísticamente significativa (datos no mostrados). Para evitar el stress de la individualización, los peces fueron alojados juntos como un grupo de peces tratados y no tratados en cubos de un mes y les proporcionará cantidades coincidentes de los alimentos. La limitación de esta configuración es que los peces pueden no estar recibiendo la misma comida sobre una base individual. Sin embargo, en el modelo de grupo, los peces tratados en el peso y el control de los peces perdidos promedio en peso ganado promedio (Tabla 3). No parecía la cantidad de alimento que los peces estaban consumiendo a ser afectados por la exposición a antibióticos antes, por lo que la supresión del apetito es una explicación poco probable candidato por falta de aumento de peso. Numerosos otros factores podrían contribuir, incluyendo cambios en la inflamación en el intestino, los niveles de producción de moco, la permeabilidad del intestino, y / o la motilidad intestinal. Una ventaja importante de este ensayo para medir Nutritiefectos onal es la simplicidad. Es barato, y sólo requiere una balanza de laboratorio como la instrumentación. Es adecuado para la detección de un efecto, que conduce a otra experimentación involucrado para determinar mecanismo.
Un factor ejemplo para examinar en relación con el aumento de peso de los peces es el tiempo de tránsito de alimentos, que está relacionada con la motilidad gut. dextrano marcado con FITC se puede incorporar en alimentos gelatinizado y es no letal para los peces. La medición de la fluorescencia en el agua que rodea el paso del tiempo da una medida de la rapidez con la FITC-dextrano se pasa a través del intestino. La fluorescencia por encima del fondo puede ser detectado tan pronto como 2 horas, con un máximo alcanzado después de 16 horas de post-alimentación (Figura 4). Este resultado es con peces de control de un acuario. Aún no se han obtenido resultados fiables a partir de los peces tratados con antibióticos. Una limitación de este procedimiento es que se requiere un período de inanición 2-d para los peces para comer la comida. un adv antage del protocolo es de alta sensibilidad (baja fluorescencia de fondo), como comer pescado sólo una sección de alimentos puede dar resultados, aunque los datos son más consistentes cuando se comen dos secciones. Este protocolo es menos complicado que un método similar y letal para los ratones 23.
Figura 1: Esquema general del Protocolo Experimental Común. A es una que ilustra diagrama de flujo, de izquierda a derecha, peces transferidos desde el tanque del acuario, separados en grupos tratados con antibióticos (representado por el agua de color rojo) o de control (azul), y luego se coloca en copas individuales para realizar un seguimiento de los fenotipos. B y C representan el proceso de extracción de los microbiomas piel de pescado y de la tripa. Después de agitación con vórtex, las bacterias se suspendieron en la solución para el análisis de la comunidad microbiana.55170 / 55170fig1large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Susceptibilidad de patógenos. Una curva de supervivencia durante la exposición a E. ictaluri para los peces tratados previamente con rifampicina (línea roja) o un grupo de control sin tratar (línea de color negro) de pescado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: La susceptibilidad al estrés osmótico. Una curva de supervivencia durante la exposición a la alta salinidad de los peces en los dos grupos tratados con antibióticos y sin tratar. Please clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Alimentos Tiempo de tránsito. Fluorescencia con el tiempo en el agua a partir de dos peces alimentados con FITC-dextrano. A los peces se comió dos secciones de alimentos de gelatina de pescado y B comió uno. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: Susceptibilidad de alto microbianos entornos. La exposición a la materia fecal humana se evaluó a 3 concentraciones diferentes. relación de la muerte de x: y muestra el número total de peces muertos en el punto x tiempo indicado en comparación con el número total de peces en el grupo experimental y.
Tabla 2: Toxicidad del nitrato Challenge. Grabado momento de mortalidad de los peces en los grupos tratados y de control a lo largo de la exposición a una concentración de nitratos tóxicos. relación de la muerte de x: y muestra el número total de peces muertos en el punto x tiempo indicado en comparación con el número total de peces en el grupo experimental y.
Tabla 3: Análisis de Crecimiento. Los cambios en el peso corporal total después de un mes después del tratamiento con antibióticos o control. La diferencia porcentual en el peso corporal medio inicial (para los peces en ese grupo de prueba) en comparación con el peso corporal promedio final es la columna Δweight. N es el número de peces en ese grupo. El peso medio por pez en el final de la prueba es de bajo peso / pescado.
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Discussion
Algunos retos requieren un período de descanso en APW limpia después del tratamiento con antibióticos para que el fármaco se haya agotado en tejidos de peces. Si se omite el periodo de descanso después presencia de antibióticos puede confundir los resultados, especialmente cuando el ensayo implica la exposición a las bacterias. Con el fin de examinar los efectos de una composición microbioma alterada sin grandes cambios en el número total de microbios en el host, los experimentos preliminares composición microbioma monitoreo (16S perfiles o la secuenciación del genoma completo) y la densidad de población (16S cuantificación mediante qPCR) durante la exposición a antibióticos sería necesario. Mientras que 3 d es óptimo en este sistema, el cambio de la acogida y / o antibiótico requeriría recalibración.
Típica de la investigación biomédica, el modelo de ratón se utiliza comúnmente para estudios microbioma. El modelo de pescado más común es el pez cebra. Con el fin de obtener una mejor comprensión de las propiedades universales de la estructura y función de la mucosa microbiomes y las interacciones huésped, modelos nuevos y atípicos son una necesidad. Nuestro modelo de pescado WT sirve como una fuente auténtica para el estudio de las interacciones huésped-microbioma incluyendo huésped natural variabilidad genética que otros modelos han perdido debido a generaciones de endogamia de los animales de laboratorio elevada 24. Una de las principales ventajas experimental de Gambusia es su naturaleza robusta, tolerando una amplia gama de condiciones. Las altas tasas de supervivencia se han observado en agua que varía de la temperatura (4-38 ° C), la salinidad (0-17 mg / ml), oxígeno disuelto (110-25%) y pH (4-8). Esto permite no sólo el examen de muchas condiciones ambientales, sino también para varios pasos procedimientos experimentales que son a menudo demasiado estresante para otras especies de peces.
Los procedimientos que aquí se presentan son adecuados para la detección rápida de descubrir los efectos de acogida de un tratamiento en particular. Se requieren estudios de seguimiento para determinar la causalidad directa y el mecanismo. Ejemplo extensión Studies para los peces efectos anfitrionas microbioma incluyen: la medición de la inflamación intestinal, el examen de salud de los peces mediante la cuantificación de las reservas de grasa, y la medición de los niveles de moco en la piel y en el intestino. Se está desarrollando un sistema de gnotobiótico para estudiar en detalle los enlaces de microbios específicos a determinados fenotipos de acogida.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rifampicin | Calbiochem | 557303-1GM | |
| Sodium Nitrate | Sigma Aldrich | S5506 | |
| Fluorescein-labeled 70 kDa anionic dextran | ThermoFisher Scientific | D1823 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) tablets | Calbiochem | 6500-OP | tablets dissolve in water to make PBS |
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