의 최적화 분석<em> 생체</em> 및<em> 체외</em> 간 지방증
Summary
Here, optimized methods to generate in vivo and in vitro models of hepatic steatosis and to analyze the steatotic phenotypes and related physiological parameters are described.
Abstract
Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic study in the liver. Here, numerous assays are described to comprehensively measure the phenotype and parameters of hepatic steatosis in mouse and hepatocyte models.
Combining the physiological, histological, and biochemical methods, this system can be used to assess the progress of hepatic steatosis. In vivo, the measurements of body weight and nuclear magnetic resonance (NMR) provide a general understanding of mice in a non-invasive manner. Hematoxylin and Eosin (H&E) and Oil Red O staining determine the histological morphology and lipid deposition of liver tissue under nutrient overload conditions, such as high-fat diet feeding. Next, the total lipid contents are isolated by chloroform/methanol extraction, which are followed by a biochemical analysis for triglyceride and cholesterol. Moreover, mouse primary hepatocytes are treated with high glucose plus insulin to stimulate lipid accumulation, an efficient in vitro model to mimic diet-induced hyperglycemia and hyperinsulinemia in vivo. Then, the lipid deposition is measured by Oil Red O staining and chloroform/methanol extraction. Oil Red O staining determines intuitive hepatic steatotic phenotypes, while the lipid extraction analysis determines the parameters that can be analyzed statistically. The present protocols are of interest to scientists in the fields of fatty liver diseases, insulin resistance, and type 2 diabetes.
Introduction
비만은 선진국과 개발 도상국의 급성장 건강 문제입니다. NAFLD 환자 (1) 30 % 내지 100 범위의 유병률 자주 알코올성 지방 간 질환 (NAFLD)와 연관된 공존하는 조건 중 하나 인 것으로보고되었다. 인해 지방간, 비만의 강한 상관 관계,식이 유도 비만 (DIO) 마우스 모델은 광범위 NAFLD 2, 3, 4, 5, 6의 개발과 관련된 복잡한 분자 메커니즘을 연구하는데 사용된다. 간 지방증은 NAFLD의 초기 단계이며, 비 알코올성 지방 간염 (NASH), 간경변, 궁극적으로 간암 7 진행할 수있다. 따라서,이 방법의 전반적인 목표는 간 steatotic 조건의 동물 및 세포 모델을 생성하고 홍보하는 것입니다효율적이고 정확한 지질 측정 ovide 상세한 프로토콜. 이 모델과 측정은 또한 인슐린 저항성과 제 2 형 당뇨병 등의 대사 질환의 연구에 유용하다.
비만 NAFLD, 고지방위한 중요한 위험 인자 중 하나 인 것으로 확인 된 바와 같이, 높은 크로스 다이어트 서양식 고지방식이를 모방 (HFHS)는 마우스에서 비만을 유도하기 위해 사용된다. 이어서, 간 지방증의 정도는 다양한 방법을 사용하여 평가 될 수있다. 먼저, 체중 및 핵 자기 공명 (NMR)와 신체 조성 분석 시간 동안 먹이 지질 축적을 나타낸다. 지방 질량과 근육량은 비 침습적 실시간 방식으로 정량화 할 수있다.
또한, 자기 공명 영상 (MRI)는 전신 및 지방 간 분포 모두를 표시하기 위해 사용된다. 자기 공명 영상의 분석의 계조 신호는 명료 한 의사 컬러 화상으로 변환하고, 강도 수그레이 스케일과 컬러는 헤미 – 정량화이다. 이 기술은 살아있는 동물에서 지방 축적의 측정에 독특한 이점을 제공한다. 둘째, 간의 조직 학적 분석 간 지방증을 결정하기 위해 가장 많이 사용되는 방법이다. 오일 레드 O 염색은 간세포에서 지질 소적의 크기와 위치를 나타내고있다 Hematoxylin & Eosin 염색 얼룩, 예컨대 간세포 형태와 같은 식세포 침윤 학적 정보를 제공한다. 셋째, 클로로포름 / 메탄올을 사용하여 추출 지질 함량 분석 간 지질의 정확한 정량적 측정이다. 총 트리글리세리드 및 콜레스테롤 수준은 생화학 적 방법으로 측정 할 수있다. 중요한 지질 추출 분석 및 오일 레드 O 염색은 또한 유전자 조작 또는 약학 간세포 치료에 사용될 수있다.
본 방법의 장점은 간 steatotic 모델을 생성하는 여러 최적화 방법의 사용이다 그종합적 생체 내 및 시험관 내에서 모두 표현형을 특성화. DIO 마우스 모델은 인간 지방간 질환의 병리 및 대사 표현형 요점을 되풀이 할 수있다. 인간의 다른 대사 매개 변수가 아니라 8로이 모델에 복제 할 수 있습니다. 높은 포도당 플러스 인슐린에 응답 steatotic 간세포 모델의 생성에 유용하고 효율적이며, 많은 비용과 시간이 소요 마우스 연구의 한계를 극복한다. 함께 찍은, 이러한 방법은 영양 과부하시 간 지질 장애와 인슐린 저항성의 연구에 대한 충분하고 필수적이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
NAFLD 대사 증후군, 비만, 인슐린 내성이나 2 형 당뇨병 (T2DM) 11와 연관된 프로그레시브 간 질환의 시리즈이다. NAFLD의 특징은 지방간, 간세포에 지방의 축적이다. 여기서, 방법의 스펙트럼은 표현형 및 DIO 마우스 및 마우스 차 간세포를 사용하여 간 지방증의 파라미터를 특성화하기 위해 제공된다. 이 절차는 비 알코올성 지방간 질환 및 기타 관련 대사 질환의 분자 메커니즘을 규?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We appreciate Feifei Zhang for the helpful discussions. We are grateful to Jing Gao and Yixuan Sun for the technical assistance and to Zhengshuai Liu and Fengguang Ma for the animal studies.
Materials
| O.C.T compound | SAKURA | 4583 | |
| Oil Red O | Sigma | O0625-25G | |
| Infinity Triglycerides kit | Fisher Scientific | TR22421 | |
| Infinity Cholesterol kit | Fisher Scientific | TR13421 | |
| Collagen type I, Rat tail | Millipore | 08-115 | |
| DMEM (low glucose) | Invitrogen | 11885-092 | |
| Penicillin / Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| FBS | Invitrogen | 10099141 | |
| PBS | cellgro | R21-040-CVR | |
| HBSS | cellgro | 20-021-CV | |
| Insulin | TOCRIS Bioscience | 3435 | dissolve in PBS, 1mM for stock |
| Glucose | Sigma | G8270-100G | |
| Microscope | Olympus | BX53 | |
| Peristaltic pump | Longerpump | BT100-2J | |
| 10cm cell culture dish | Corning | 420167 | |
| 6-well-plate | Corning | 3516 | |
| BCA assay | Beyotime | P0010 | |
| Nuclear Magnetic Resonance | Niumag technology | MiniQMR23-060H-I | |
| High fat high surcose diet(HFHS) | Research Diets | D12327 |
Referências
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