משלוח הממברנה ממוקד על Encapsulated מטענים הידרופובי בנושאת Nanoparticle קריסטל נוזלת
Summary
ננו-חלקיק גביש נוזלי (LCNP) nanocarrier מנוצלת ככלי עבור במסירה מבוקרת של מטען הידרופובי אל קרום הפלזמה של תאים חיים.
Abstract
המשלוח המבוקר של סוכני סמים / הדמיה לתאים הוא קריטי עבור בפיתוח תרופות לחקר תהליכי איתות הסלולר. לאחרונה חלקיקים (NPS) הראו הבטחה משמעותית לפיתוח של מערכות שיגור כזה. כאן, מערכת מסירה מבוססת גביש נוזל NP (LCNP) הועסקה על במסירה המבוקרת של צבע מים מסיסים, פרכלורט-dioctadecyloxacarbocyanine 3,3' (DIO), מתוך ליבת NP לאזור ההידרופובי של פלזמה bilayer הממברנה. במהלך הסינתזה של הצירופים, לצבוע התאגד ביעילות לתוך ליבת LCNP הידרופובי, כפי שאושר על ידי ספקטרוסקופיות מרובים המנתח. נטיה של נגזרת כולסטרול PEGylated אל פני השטח NP (Dio-LCNP-PEG-חול) איפשר המחייב של צירופים טעון לצבוע הממברנה ב HEK 293T / 17 תאים. זמן נפתרה מיקרוסקופיה confocal סריקת לייזר והעברת אנרגיה תהודה פורסטר (סריג) הדמיה אישר את המסירהive בזרימה של Dio מליבת LCNP והחדרתו לתוך bilayer הממברנה. לבסוף, את המסירה של Dio בתור LCNP-PEG-צ'ול החלישה את cytotoxicity של Dio; בצורת NP של Dio הציגה ~ 30-40% פחות רעילה לעומת DIO מובא חינם מפתרון בתפזורת. גישה זו ממחישה את השירות של פלטפורמת LCNP כקובץ האפנות ביותר עבור משלוח הקרום ספציפי אפנון של מטענים מולקולריים הידרופובי.
Introduction
מאז כניסתו של התממשקות ננו (חומרים ≤100 ננומטר לפחות ממד אחד) עם תאי חיים, מטרה מתמשכת כבר לנצל את מאפייני גודל תלוי הייחודיים של חלקיקים (NPS) עבור יישומים שונים. יישומים אלה כוללים תא ו / תיוג רקמות הדמיה (הן במבחנה in vivo), חישה בזמן אמת, ואת במסירה מבוקרת של תרופות ומטענים אחרים 1. דוגמאות של תכונות NP רלוונטיות אלו כוללות את הפליטה תלוי בגודל של nanocrystals מוליך למחצה (נקודות קוונטיות, QDs); מאפייני photothermal של חלקיקי זהב; יכולת ההעמסה הגדולה של הליבה המימית של ליפוזומים; ואת מוליכות בליסטיים של allotropes פחמן, כגון צינורות פחמן חד-הקיר גרפן.
לאחרונה, עניין משמעותי שקם בשימוש צירופים עבור האפנון המבוקר של תרופות ומטענים אחרים, כגון ניגוד / הדמיהגברים. הנה, את הרציונל הוא לשפר משמעותית / לייעל את המסיסות הכוללת, מינון נמסר, זמן מחזור, ופינוי סופי של מטען הסמים על ידי מתן אותו בתור ניסוח NP. זה הגיע להיות המכונה משלוח סמים בתיווך NP (NMDD), וכיום ישנם שבעה ניסוחים סמים NP ה- FDA לשימוש במרפאה לטיפול בסוגי סרטן שונים ומאות נוספים בשלבים שונים של ניסויים קליניים. בעיקרו של דבר, המטרה היא "להשיג יותר בפחות;" כלומר, להשתמש NP כמו פיגום כדי לספק סמים יותר עם ממשלי מינון פחות על ידי ניצול של שטח הפנים הגדול: נפח (למשל, חלקיקים קשים, כגון QDs תחמוצות מתכת) של צירופים או נפח הפנים הגדול שלהם לטעינה מטעני מטען גדולים (למשל, ליפוזומים או מיצלות). המטרה כאן היא לצמצם את הצורך המשטר מינון מרובה נמסרו מערכתי בעוד באותו הזמן בקידום יציבות מימית ומחזור דם מוגבר, במיוחד עבורמטעני תרופה הידרופובי ומאתגרים, תוך יעיל, הם מסיסים במשורה בתקשורת המימית.
לפיכך, המטרה של העבודה המתוארת במסמך זה הייתה לקבוע את הכדאיות של שימוש פיגום NP רומן עבור המשלוח הייחודי והמבוקר של מטענים הידרופובי אל bilayer הממברנה lipophilic. מוטיבצית העבודה הייתה המסיסות מוגבלת הטמון וקושי מסירת מולקולות הידרופוביות לתאי מהמדיה מימית. בדרך כלל, את המסירה של מולקולות הידרופוביות כזה דורש שימוש בממסים אורגניים (למשל, DMSO) או פעיל שטח amphiphilic (למשל Poloxamers,) שיכול להיות תא רעיל ופשרה ורקמות כדאיות 2, או נישא micelle, אשר יכולה להיות מוגבל טעינה פנימית קיבולות. מנשא NP נבחר כאן היה ניסוח רומן גביש נוזל NP (LCNP) שפותח בעבר 3 וכי הוכח בעבר להשיג ~ פי 40 שיפור היעילות של דוקסורוביצין התרופה נגד הסרטן בתאים בתרבית 4.
בשנת העבודה המתוארת במסמך זה, מטען הנציג שנבחר היה צבע קרום פוטנציומטרית, 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine פרכלורט (DIO). DIO הוא צבע מסיס-מים, שבו נעשה שימוש עבור האנטרוגרד התחקות מדרדר חיים ונוירונים קבועים, מדידות פוטנציאל הממברנה, ועל קרום כללי תיוג 5, 6, 7, 8, 9. בשל האופי הידרופובי שלה, בדרך כלל DIO מתווסף ישירות monolayers תא או רקמות בצורה גבישית 10, או שהוא וטופח בריכוזים גבוהים מאוד (~ 1-20 מיקרומטר) לאחר דילול מפתרון מניות ריכוז 11, 12.
תוכן "> הנה, גישת שימוש הייתה לפלטפורמת LCNP, NP רב תכליתי אשר גרעין פנימי הוא לגמרי הידרופובי השטח שלה הוא הידרופילי בו זמנית מקובל bioconjugation, כרכב משלוח עבור Dio. DIO הוא שולב ליבת LCNP במהלך סינתזה , ועל פני שטח NP הוא פונקציונלי אז עם מחצית כולסטרול PEGylated לקדם את הממברנה המחייב של אנסמבל DIO-LCNP קרום הפלזמה. גישה זו ביאת מערכת מסירה כי חלקה את DIO לתוך קרום הפלזמה עם דיוק גדול ומגורי הממברנה זמן מאשר בצורה חופשית של Dio נמסר מפתרון בתפזורת (Dio חינם). יתר על כן, שיטה זו הראה כי משלוח בתיווך LCNP של Dio מודולציה משמעותי שמניע את שיעור החלוקה הספציפית של צבע לתוך bilayer הממברנה lipophilic. זהו מושגת תוך הפחתת הרעילות של התרופה בחינם על ידי ~ 40% על ידי אספקה אותו כקובץ ניסוח LCNP במקביל. <p clהתחת = "jove_content"> זה צפוי כי המתודולוגיה המתוארת במסמך זה יהיה טכניקה המאפשרת עוצמה עבור חוקרים שעבודתם כרוכה או מחייב משלוח הסלולר של מטענים הידרופובי מאוד כי הם מסיסים במשורה או לא מסיסים לחלוטין בתמיסה מימית.Protocol
Representative Results
Discussion
מטרה מתמשכת של NMDD היא המיקוד המבוקר מסירת ניסוחי תרופה לתאים ורקמות, בשילוב עם יעילות תרופה משופרת סימולטני. אחת מסוג ספציפי של מולקולות תרופה עבורו זו הציבה בפני אתגר משמעותי הוא סוכנים הידרופובי תרופות / הדמיה שיש במשורה, כדי לא מסיסות תקשורת מימית. בעיה זו הטרידה א…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי תכנית מימון מאגר NRL (עבודת יחידת MA041-06-41-4943). ON נתמך על ידי Associateship מחקר מלגות המועצה הלאומית למחקר.
Materials
| 1-ethyl-3-(3-(dimethylamino)-propyl)carbodiimide hydrochloride (EDCA) | ThermoFisher | E2247 | |
| 3,3′-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO) | Sigma Aldrich | D4292-20MG | Hazardous/ make stock solution in DMSO |
| Cholesterol poly(ethylene glycol) amine hydrochloride | Nanocs, Inc. | PG2-AMCS-2k | |
| Countess automated cell counter | ThermoFisher | C10227 | |
| Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) | Sigma Aldrich | 468495-100MG | Hazardous/ make stock solution in DMSO |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ThermoFisher | 21063045 | Warm in 37°C before use |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | ThermoFisher | 14040182 | Warm in 37°C before use |
| Dynamic light scattering instrument | ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK) | ||
| Fibronectin Bovine Protein, Plasma | ThermoFisher | 33010018 | Make stock solution 1mg/mL using DPBS. Use 20-30 µg/mL for coating MetTek dish, 2 h@ 37°C |
| Formaldehyde (16%, W/V) | ThermoFisher | 28906 | Hazardous, dilute to 4% using DPBS |
| Human embryonic kidney cells (HEK 293T/17) | American Type Culture Collection | ATCC® CRL-11268™ | |
| Live cell imaging solution (LCIS) | ThermoFisher | A14291DJ | Warm in 37°C before use |
| MatTek 14 mm # 1.0 coverglass insert cell culture dish | MatTek corporation | P35G-1.0-14-C | |
| Modified Eagle Medium (DMEM) containing 25 mM HEPES | ThermoFisher | 21063045 | Warm in 37°C before use |
| N-hydroxysulfosuccinimide sodium salt (NHSS) | ThermoFisher | 24510 | |
| Nikon A1si spectral confocal microscope | Nikon Instruments | ||
| Trypan Blue Stain (0.4%) | ThermoFisher | T10282 | mix as a 50% to the cell suspension before counting the cells |
| Zeta potential instrument | ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK) | ||
| Ultrasonic Processor | Sonics and Materials Inc | GEX 600-5 | |
| Mini Cetntrifuge | Benchmark | Mini-fuge-04477 | |
| PD-10 Sephadex™ G-25 Medium | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| Bio-Rad ChemiDoc XRS Imaging System | Bio-RAD | 76S/07434 | |
| Trypsin-EDTA(0.25%), phenol red | ThermoFisher | 25200056 |
Referências
- Nag, O. K., Field, L. D., Chen, Y., Sangtani, A., Breger, J. C., Delehanty, J. B. Controlled actuation of therapeutic nanoparticles: an update on recent progress. Ther. Deliv. 7 (5), 335-352 (2016).
- Galvao, J., Davis, B., Tilley, M., Normando, E., Duchen, M. R., Cordeiro, M. F. Unexpected low-dose toxicity of the universal solvent DMSO. FASEB J. 28 (3), 1317-1330 (2014).
- Spillmann, C. M., Naciri, J., Anderson, G. P., Chen, M. S., Ratna, B. R. Spectral tuning of organic nanocolloids by controlled molecular interactions. ACS Nano. 3 (10), 3214-3220 (2009).
- Spillmann, C. M., Naciri, J., Algar, W. R., Medintz, I. L., Delehanty, J. B. Multifunctional Liquid Crystal Nanoparticles for Intracellular Fluorescent Imaging and Drug Delivery. ACS Nano. 8 (7), 6986-6997 (2014).
- Timmers, M., Vermijlen, D., Vekemans, K., De Zanger, R., Wisse, E., Braet, F. Tracing DiO-labelled tumour cells in liver sections by confocal laser scanning microscopy. J. Microsc. 208 (Pt 1), 65-74 (2002).
- Mufson, E. J., Brady, D. R., Kordower, J. H. Tracing neuronal connections in postmortem human hippocampal complex with the carbocyanine dye DiI. Neurobiol Aging. 11 (6), 649-653 (1990).
- Köbbert, C., Apps, R., Bechmann, I., Lanciego, J. L., Mey, J., Thanos, S. Current concepts in neuroanatomical tracing. Prog. Neurobiol. 62 (4), 327-351 (2000).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and DiO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends Neurosci. 12 (9), 333-341 (1989).
- Gan, W. B., Bishop, D. L., Turney, S. G., Lichtman, J. W. Vital imaging and ultrastructural analysis of individual axon terminals labeled by iontophoretic application of lipophilic dye. J. Neurosci. Methods. 93 (1), 13-20 (1999).
- Godement, P., Vanselow, J., Thanos, S., Bonhoeffer, F. A study in developing visual systems with a new method of staining neurones and their processes in fixed tissue. Development. 101 (4), 697-713 (1987).
- Ragnarson, B., Bengtsson, L., Haegerstrand, A. Labeling with fluorescent carbocyanine dyes of cultured endothelial and smooth muscle cells by growth in dye-containing medium. Histochemistry. 97 (4), 329-333 (1992).
- Korkotian, E., Schwarz, A., Pelled, D., Schwarzmann, G., Segal, M., Futerman, A. H. Elevation of intracellular glucosylceramide levels results in an increase in endoplasmic reticulum density and in functional calcium stores in cultured neurons. J. Biol. Chem. 274 (31), 21673-21678 (1999).
- Garrett, R. H., Grisham, C. M. . Bioquímica. , (2013).
- Berne, B. J., Pecora, R. . Dynamic Light Scattering. , 41155-41159 (2000).
- Kremers, G. J., Piston, D. W., Davidson, M. W. . Basics of FRET Microscopy. , (2016).
- Chen, H., Kim, S., Li, L., Wang, S., Park, K., Cheng, J. X. Release of hydrophobic molecules from polymer micelles into cell membranes revealed by Förster resonance energy transfer imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6596-6601 (2008).
- Campling, B. G., Pym, J., Galbraith, P. R., Cole, S. P. C. Use of the MTT assay for rapid determination of chemosensitivity of human leukemic blast cells. Leukemia Res. 12, 823-831 (1988).
- Nag, O. K., Naciri, J., Oh, E., Spillmann, C. M., Delehanty, J. B. Lipid raft-mediated membrane tethering and delivery of hydrophobic cargos from liquid crystal-based nanocarriers. Bioconjug. Chem. 27 (4), 982-993 (2016).
- Karve, S., et al. Revival of the abandoned therapeutic wortmannin by nanoparticle drug delivery. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (21), 8230-8235 (2012).
