ここで、我々は、ヒト臍帯(UC)および臍帯に胎児胎盤サンプル単離のための(CL)、ウォートンゼリー(WJ)、臍帯胎盤接合(CPJ)、および胎児胎盤(FP)裏地の解剖のためのプロトコルを提示しますそして外植片培養技術を用いて、間葉系間質細胞(MSC)の特徴付け。
ヒト臍帯(UC)および胎盤は、彼らがどんな倫理的あるいは道徳的な懸念を提起していないので、ますます注目を集めている間葉系間質細胞(MSC)の非侵襲的、原始的と豊富な源です。 UCからMSCを分離するための現在の方法は、可変の増殖ポテンシャルを有する細胞の低量が得られます。 UCは、解剖学的に複雑な器官であるため、MSCの特性の違いは、それらの単離の解剖学的領域の違いに起因し得ます。 UC、臍帯胎盤接合(CPJ)、および胎児胎盤(FP):本研究では、最初の3つの別個の解剖学的領域にコード/胎盤サンプルを解剖しました。第二に、二つの異なるゾーン、コードライニング(CL)及びウォートンゼリー(WJ)は、分離しました。外植片培養技術は、その後4つの源から細胞を単離するのに使用しました。外植片からの細胞の初代培養に必要な時間は、組織の供給源に依存して変化しました。 4ダ – 細胞の増殖は、3以内に発生しましたCPJ外植片のYS、成長が7の後に観察された – それぞれ、CL / WJ及びFP外植片から14日 – 10日及び11。単離された細胞はプラスチックに付着したと同様に、骨髄(BM)由来のMSCに、例えばCD29、CD44、CD73、CD90、およびCD105などの線維芽細胞様形態および表面マーカーを、表示しました。しかしながらCPJ-MSCおよびBM-MSCのより高い効率を示すWJ-MSCを用いて、変化した細胞を、コロニー形成効率。 4つのすべてのソースからのMSCは、それらが多能性であったことを示す、脂肪生成、軟骨形成、及び骨形成系統に分化しました。 CPJ-MSCは、他のMSC源と比較して、より効率的に分化しました。これらの結果は、CPJは、最も強力な解剖学的領域であり、in vitroでのより大きな増殖と自己複製能力を有する細胞の高い数を、生み出すことを示唆しています。結論では、4つのソースからのMSCの比較分析は、CPJは、細胞療法のためのMSCのより有望な源、regenerativであることを示し電子薬、および組織工学。
幹細胞は様々な臓器や身体の組織に存在します。彼らは再生能力を有し、人間の生命1、2のスパンを通じて体内に損傷を受けた組織の修復に大きな役割を果たしています。これは、特に以来、成体幹細胞(ASCに)、で大きな関心を生成した胚性幹細胞(ESC)とは異なり、ASCの使用は道徳的、倫理的ジレンマをもたらすことはありません。いくつかの研究は、間葉系間質細胞(MSC)のように、ASCの単離を報告しています。造血幹細胞(HSC);骨髄(BM)から脂肪組織(AT)および歯髄3、4、5の範囲の様々な大人のソースを含むと異なる前駆体、。しかし、成人のニッチのほとんどに存在するASCの数は限られており、それらの単離は、一般的に可能ドナーと侵襲性と痛みを伴う手順を含みますサイトの罹患率。また、ドナーの年齢や環境ストレスも単離された細胞6、7、8の品質および生物学的活性を決定する上で重要な役割を果たすことができます。 ASCはまた、in vitroでの培養中に限られた増殖と分化能を表示します。
現在のASCのこれらの欠点を克服するために、新しいソースは、幹細胞を単離するために追求されてきました。これらの努力は、臍帯血、臍帯組織、胎盤、羊水9を含む周産期のソースからの幹細胞の単離、につながっています。これらのソースは、その簡単で、豊富な可用性10、11、12、13の注目を集めています。また、周産期組織は、非侵襲的に得られ、それらから誘導された幹細胞ことができます成人源14,15から単離されたASCよりプリミティブ。彼らは、出生時に得られた組織から分離されており、経年変化や環境ストレス16にゲノムに最小限の変化を受けていると考えられます。
しかし、自己複製ならびに分化するように周産期源及びそれらの可能性からの幹細胞の報告された特性は、17、11広く変えます。これは、ヒト臍帯(UC)は複雑な器官であるという事実に一部である可能性があります。私たちは、周産期の組織の別個の領域がバリエーションと非周産期源由来のASCと比較してこれらの幹細胞のより原始的な性質を担当する特定のニッチを作成すると仮定しました。 UC、臍帯胎盤接合(CPJ):この研究は、三の別個の解剖学的領域にコード/胎盤サンプルの解剖を説明しますD胎児の胎盤(FP)。コードライニング(CL)とウォートンのゼリー(WJ):UCは、さらに2つのゾーンに解剖しました。 CL、WJ、CPJ、及びFPから単離された細胞の分析は、それら全てが線維芽細胞様の形態を示し、MSCマーカーを発現することを実証したが、彼らは彼らの自己再生および分化能が異なります。 CPJ由来の細胞は、それらの細胞治療、再生医療、および組織工学のためのより多くの有望なソース作り、UC-とFP由来細胞と比較して高い増殖率と自己複製能を示しました。
幹細胞研究の最近の進歩は、基本的な開発プロセスの理解を改善だけでなく、バイオテクノロジー、製薬、細胞治療、再生医療、および組織工学アプリケーション18、19、20における幹細胞の使用のための有望な機会を提供していないだけ。初期胚から分離された多能性ESCのが最も有望であるが、それらは技術的な課題と倫理的ジレンマ21、22、23に直面しています。成体細胞由来誘導多能性幹細胞(性IPSC)は、代替手段を提供しますが、彼らはあまりにも同様の技術的および安全性の問題に直面している23。さらに、性IPSCは、遺伝的に安定ではないかもしれないか、従って、それらの治療的使用を制限し、遺伝的変化を受けていてもよいです。幹細胞は、出生後のTISの様々な報告されています訴えると臓器。これらのASCの最も一般的な発生源は、骨髄、脂肪、および筋肉組織です。しかし、出生後の発生源からのASCは、増殖および分化の可能性24、25が限られています。彼らはまた、経年や環境ストレスへの暴露に苦しむので、常に治療への応用26、27、28のために有効ではありません。これは、ASCをよりナイーブである幹細胞の新しいソースを検索するために、私たちと他の人をリードしてきました。
当社は、ASCをの代替として原始的な幹細胞の周産期情報源を調査しました。本稿では、コード/胎盤サンプルからヒトMSCを単離するために、信頼性の高い堅牢、かつ簡単な方法を提供します。 ASCの単離のために使用される他の供給源および方法と比較して、この方法は、HIGを大量に単離するための効率的かつ非侵襲的な方法を提供しますH-品質のMSC。それは、さらに、BMとして大人のソースからのMSCに比べて周産期のMSCのより高い増殖および分化の可能性を強調する。
胎盤に胎児を取り付けるUCは、二つの動脈、静脈、CL、及びWJ(血管の周囲の組織)を含む別個の解剖学的領域と大きい器官です。いくつかの研究は、可変の増殖および分化ポテンシャル25で、29の全体のコードからのMSCの単離、WJ、または胎盤を報告しています。それにもかかわらず、現在までに、何の研究では、効果的に調査しないとコード/胎盤試料の異なる解剖学的領域から細胞を比較しました。ここではMSCの単離のためのUC、CPJ、および接続されたFPの解剖のための体系的かつ簡単な方法を提供します。また、その増殖のcapabilを決定することによって、特徴づけ、単離された細胞の品質を評価するために、包括的かつシンプルなプロトコルを表示しますities、並びにそれらの自己複製と分化ポテンシャル。この方法は、再現性があり、かつ、優れた品質のMSCの大規模な量を生み出します。
我々は、単一の細胞内への組織の完全な消化が単離された細胞の低い収率を持っていたのに対し、市販のトリプシン溶液を使用して、サイズが組織片の部分消化1〜2ミリメートルの再現性、外植片から細胞をもたらしたことがわかりました。しかし、ある研究は、UCの大きな組織外植片のサイズの約10mmの細胞の単離30のために最適であったことを報告しました。逆に、別の研究では、組織外植片法は、酵素消化法31と比較してより長い培養周期と細胞のより低い収率をもたらしたことを示唆しました。以前の報告では、コードの処理は、コラゲナーゼIIおよびヒアルロニダーゼ、別々に、またはトリプシンを以下で組織、臍帯細胞32、33を単離するために行われてきました<sup> 34。だけでなく、前培養に、臍帯組織の消化方法のばらつきの大きな取引がありますが、また、単離された細胞は異質であるように思われました。より長い期間のために過酷な酵素の使用は、細胞接着および増殖に影響を与え、細胞膜を劣化させることができます。この方法の結果は、部分的に消化された周産期組織外植片は、広範な細胞損傷を引き起こすことなく、細胞の成長を提供することが示された生存率を維持し、MSCの同種集団のより高い量を得ました。
外植片からの細胞の解離および分離するためのプロトコルは簡単であるが、ステップのいくつかは、困難になるかもしれません。まず、培養フラスコの表面への付着を可能にすることによって、外植片の付着を確実にします。これは培養の最初の2時間のために組織片をカバーする、媒体の少量を使用し、次いで注意深く残りの培地を添加することによって容易にすることができます。 Second、T75フラスコあたり15未満に外植片の数を制限します。フラスコあたりピースまたはあまりにも多くの作品の間にあまりにも小さなスペースでは、細胞成長のために抑制されています。インキュベーションの3日後に培養フラスコの表面に付着しない第三に、組織片を遵守し、培養のために新しいフラスコに転送する必要があります。第四に、培養される組織片は、添付ファイルを阻害する細胞破片の自由でなければなりません。第五に、大部分の培養は、より多くのメディアを必要とし、細胞の伸長効率を改善しません。細胞が急速にコンフルエントになり、組織源に応じて区別できるように最後に、特に細胞成長の出現後に、密接に外植片培養物をモニターします。技術のいくつかの制限がCL、WJ、CPJ、及びFPを分離するために試料を解剖の専門知識の欠如が挙げられます。低WJの収率で得られたサンプルサイズが小さいです、。そして遅延加工試料をAVOする収集の2~4時間以内に処理する必要がありますID細胞回復の損失。
MSCの特徴づけのためのゴールドスタンダードは、プラスチックに付着線維芽細胞の表現型を形成し、複数の系統に分化する能力です。これらはまた、ISCT 35によって記載されるようにMSCを定義するための一般的に使用される基準です。本研究では、4つ全ての供給源から単離された細胞はプラスチックに付着しており、MSCマーカー(CD29、CD44、CD73、CD90、およびCD105)造血マーカーCD45について陰性発現について陽性発現が認められました。加えて、それらは、ヒト白血球抗原(HLA)クラスIを発現するがHLAクラスIIについて陰性でした。 BM-MSCは、WJ-とCPJ由来細胞に比べて高かったです。これらの結果は、UC由来MSC 33、36、37、38の以前の報告と一致しています。加えて、我々の結果は、CL-、WJ-、CPJ-は、FP-MSCは多能発現することを示しましたそのようなOCT4、NANOG、およびSOX2として効力遺伝子;以前に報告されたように39しかし、彼らの表現は、ESCのそれよりも低かったです。これらの結果は、周産期由来細胞40における多能性マーカーの発現を報告した以前の研究と一致してもいました。興味深いことに、それは多能性マーカーの発現は、他の供給源から単離された細胞におけるよりCPJ-MSCの中に高かったことが観察されました。また、UC-MSCがBM-MSCの41を上回る自己複製能を示したことに気づきました。興味深いことに、表現型の特徴の類似性にもかかわらず4つの供給源から単離された細胞は、可変CFE値を有していました。しかし、FP-MSCを除き、それらはすべてBM-MSCのより良いCFE値を有していました。他のすべてのMSCと比較するとCPJ-MSCは増殖の最高CFE値とレートを持っていました。また、WJ-とCPJ-MSCがBM-MSCのより高い分化能を示しました。 CL-MSCは少なくとも分化を示しました。すべての3つの系統( すなわち、脂肪生成、軟骨、および骨形成)への潜在的な、CPJ-MSCは最高trilineageの分化能を有しており、FP-MSCは少なくとも脂肪生成分化能を表示するのに対し。
結論として、我々の結果は、単離されたMSCの質と量がコード/胎盤サンプルの4つのソース間で異なることを示しました。 CPJ-MSCは、より多くの増殖能力と大きな自己再生能力を持っていました。彼らはtrilineage細胞型への分化にも強力でした。それらの低倍加時間に、CPJ-MSCは、急速に1000倍に拡大することができ、高スループット薬物または生体材料のスクリーニングのために使用します。これらの細胞は、細胞治療や再生医療アプリケーションのためのより多くの有望な供給源である可能性があります。
The authors have nothing to disclose.
研究は、OU-WB ISCRM、オークランド大学とミシガン頭と背骨研究所によってサポートされていました。 N・ベアーラボルとC・マッキーオークランド大学から学長大学院研究賞を受賞しました。私たちは、原稿を見直すためS.バクシを感謝しています。
DMEM with 4500 mg/ml glucose | Invitrogen | 11995065 | |
FBS | Aleken Biologicals | FBSS500 | |
Isobutyl-methylxanthine | Sigma | I5879-250mg | |
Dexamethasone | Sigma | D4902-100mg | |
Insulin | Prospec | CYT-270 | |
Indomethacin | Sigma | I7378-5G | |
TGFβ1 | Prospec | CYT-716 | |
Ascorbic acid | Sigma | A-7631 | |
Ascorbate 2-phosphate | Sigma | A-8960 | |
β-glycerophosphate | Sigma | G-6251 | |
TrypLE | Invitrogen | 50591419 | |
GeneJET RNA purification kit | Thermo Scientific | K0732 | |
DNase | Promega | M6101 | |
iScript kit | Biorad | 1708891 | |
Sso-Advanced Universal SYBR Green Supermix Kit | Biorad | 1725274 | |
4% paraformaldehyde | Affymetrix | 19943 | |
OCT | Thermo Scientific | SH75-125D | |
Oil Red O | American MasterTech Scientific | STORO100 | |
Toluidine blue | Thermo Scientific | S71363 | |
Crystal violet | Sigma | C3886 | |
Alizarin red stain | Thermo Scientific | S25131 | |
APC Mouse anti-Human CD29 | BD Biosciences | 559883 | |
APC Mouse anti-Human CD34 | BD Biosciences | 555824 | |
FITC Mouse anti-Human CD44 | BD Biosciences | 555478 | |
FITC Mouse anti-Human CD45 | BD Biosciences | 555482 | |
APC Mouse anti-Human CD73 | BD Biosciences | 560847 | |
FITC Mouse anti-Human CD90 | BD Biosciences | 561969 | |
APC Mouse anti-Human CD105 | BD Biosciences | 562408 | |
Centrifuge | IEC | 93522M-2 | |
CO2 incubator | Thermo Scientific | Hera Cell 150i | |
Light microscope (LM) | Nikon Instruments Inc. | Olympus | |
Hemacytometer | Thermo Scientific | 0267151B | |
Cryostat | Leica | CM3050 S | |
FACS Canto II and Diva Software | BD Biosciences | Canto II | |
Thermocycler | MJ Research Inc. | PTC-100 | |
Real-Time PCR System | Bio-Rad | CFX96 |