Her præsenteres en protokol for dissektion af human navlestreng (UC) og føtal placenta prøven i ledning foring (CL), Whartons gelé (WJ), snor-placenta motorvej (CPJ), og føtal placenta (FP) til isolering og karakterisering af mesenchymale stromale celler (MSC'er) under anvendelse af eksplantatet dyrkningsteknik.
Den menneskelige navlestreng (UC) og placenta er ikke-invasive, primitive og rigelige kilder til mesenkymale stromale celler (MSC), der i stigende grad har fået opmærksomhed, fordi de ikke udgør nogen etiske eller moralske bekymringer. Nuværende fremgangsmåder til isolering MSC'er fra UC opnåelse lave mængder af celler med variable spredning potentialer. Da UC er en anatomisk-komplekst organ, kan forskelle i MSC egenskaber skyldes forskellene i anatomiske områder i deres isolation. I denne undersøgelse vi først dissekeret ledning / placenta prøver i tre adskilte anatomiske områder: UC, snor-placenta junction (CPJ), og føtal moderkage (FP). Sekund, to særskilte zoner, ledning foring (CL) og Whartons gelé (WJ), blev separeret. Eksplantatet dyrkningsteknik blev derefter anvendt til at isolere celler fra fire kilder. Den nødvendige tid til den primære dyrkning af celler fra eksplantaterne varierede afhængigt af kilden af vævet. Udvækst af cellerne forekom inden for 3 – 4 days af CPJ eksplantater, hvorimod der blev observeret vækst efter 7 – 10 dage og 11 – 14 dage efter den CL / WJ og FP eksplantater hhv. De isolerede celler blev adhærerende til plast og vises fibroblastoide morfologi og overflademarkører, såsom CD29, CD44, CD73, CD90, og CD105 svarende til knoglemarv (BM) afledte MSC'er. Imidlertid kolonidannende effektivitet af varierede celler, med CPJ-MSC'er og WJ-MSC'er, der viser højere effektivitet end BM-MSC'er. MSC fra alle fire kilder differentieret i adipogeniske, chondrogene og osteogene afstamninger, hvilket indikerer, at de var multipotente. CPJ-MSC'er differentieret mere effektivt i forhold til andre MSC kilder. Disse resultater antyder, at CPJ er den mest potente anatomiske område og giver et højere antal celler, med større spredning og selvfornyelse kapacitet in vitro. Konklusionen er, at sammenlignende analyse af MSC'erne fra fire kilder indikerede, at CPJ er en mere lovende kilde af MSC'er til celleterapi, regenerative medicin, og vævsmanipulering.
Stamceller er til stede i forskellige organer og væv i kroppen. De besidder regenerativ potentiale og spiller en stor rolle i at reparere beskadigede væv i kroppen hele span af menneskeliv 1, 2. Det har skabt en stor interesse i voksne stamceller (ASC), især da, i modsætning til embryonale stamceller (EKSF), vil brug af ASCer ikke udgør moralske og etiske dilemmaer. Adskillige undersøgelser har rapporteret isolering af ASC'er, såsom mesenchymale stromale celler (MSC'er); hæmatopoietiske stamceller (HSC'er); og forskellige progenitorer, herunder forskellige voksent kilder spænder fra knoglemarv (BM) til fedtvæv (AT) og dental pulp 3, 4, 5. Imidlertid er antallet af ASC'er stede i de fleste af de voksne nicher er begrænset, og deres isolation omfatter generelt en invasiv og smertefuld procedure med mulig donorwebsted sygelighed. Desuden kunne donor alder og miljømæssig stress også spille en væsentlig rolle i bestemmelsen af kvaliteten og biologiske aktivitet af de isolerede celler 6, 7, 8. ASC'er udviser også begrænset proliferation og differentiering potentiale under dyrkning in vitro.
For at overvinde disse ulemper ved nuværende ASC, har nye kilder blevet forfulgt for at isolere stamceller. Disse bestræbelser har ført til isoleringen af stamceller fra perinatale kilder, herunder navlestrengsblod, ledning væv, placenta og fostervand 9. Disse kilder har fået opmærksomhed på grund af deres let og rigelig tilgængelighed 10, 11, 12, 13. Endvidere perinatale væv kan opnås ikke-invasiv, og stamceller fra dem ermere primitive end ASC'er isoleret fra voksne kilder 14, 15. De er isoleret fra væv opnået ved fødslen og anses for at have undergået minimale ændringer i genomet på grund af aldring og miljøbelastninger 16.
Men de rapporterede karakteristika for stamceller fra perinatale kilder og deres potentiale til at forny sig selv samt at differentiere varierer meget 11, 17. Dette kunne delvis skyldes, at den menneskelige navlestreng (UC) er en komplekst organ. Vi hypotesen, at de diskrete områder af perinatal væv skaber specifikke nicher ansvarlige for variationer og mere primitive natur af disse stamceller i sammenligning med ASC'er afledt af ikke-perinatale kilder. Denne undersøgelse beskriver dissektion af ledning / placenta prøver i tre adskilte anatomiske områder: UC, snor-placenta junction (CPJ), end føtal placenta (FP). UC blev yderligere dissekeret i to zoner: ledning foring (CL) og Whartons Jelly (WJ). Analyse af de isolerede celler fra CL, WJ, CPJ, og FP vist, at de udviste alle fibroblastoid morfologi og udtrykt MSC markører, men de adskiller sig i deres selvfornyelse og differentiering potentiale. CPJ-afledte celler udviste en højere proliferationshastighed og selvfornyelse potentiale sammenlignet med UC og FP-afledte celler, hvilket gør dem en mere lovende kilde til celleterapi, regenerativ medicin, og vævsmanipulering.
Nylige fremskridt i stamcelleforskning ikke kun forbedret forståelse af grundlæggende udviklingsprocesser, men også lovende muligheder for anvendelse af stamceller i bioteknologiske, farmaceutiske, celleterapi, regenerativ medicin, og vævskonstruktionsanvendelser 18, 19, 20. Mens pluripotente økonomiske og sociale råd isoleret fra tidlige embryoner er de mest lovende, de står over for tekniske udfordringer og etiske dilemmaer 21, 22, 23. Inducerede pluripotente stamceller (iPSCs) afledt fra voksne celler tilvejebringe en alternativ, men også de står over for lignende tekniske og sikkerhedsmæssige problemer 23. Endvidere kan iPSCs ikke være genetisk stabile eller kan have undergået genetiske ændringer, hvilket begrænser deres terapeutiske anvendelse. Stamceller er også blevet rapporteret i mange forskellige postnatal tisanlægger og organer. De mest almindelige kilder til disse ASC'er er knoglemarven, adipose, og muskelvæv. Imidlertid har ASC'er fra postnatale kilder begrænset vækst og differentiering potentiale 24, 25. De lider også på grund af ældning og eksponering for miljømæssige påvirkninger, og derfor er det ikke altid effektive til terapeutiske applikationer 26, 27, 28. Dette har ført os og andre til at søge efter nye kilder til stamceller, der er mere naive end ASCer.
Vi har undersøgt perinatale kilder til primitive stamceller som et alternativ til ASC'er. I denne rapport, giver vi en pålidelig, robust og enkel metode til at isolere humane MSC'er fra ledning / placenta prøver. I sammenligning med andre kilder og metoder til isolering af ASC'er, tilvejebringer denne fremgangsmåde en effektiv og ikke-invasiv fremgangsmåde til isolering af store mængder HIGh kvalitet MSC'er. Det yderligere accentuerer højere vækst og differentiering potentiale perinatale MSC'er sammenlignet med MSC'er fra voksne kilder såsom BM.
UC fastgørelse af fosteret til moderkagen er et stort orgel med distinkte anatomiske områder, herunder to arterier, en vene, CL, og WJ (væv, der omgiver blodkarrene). Adskillige undersøgelser har rapporteret isolering af MSC'er fra hele ledningen, WJ, eller placenta, med variabel vækst og differentiering potentialer 25, 29. Ikke desto mindre, til dato, ingen undersøgelse har effektivt undersøgt og sammenlignet de celler fra forskellige anatomiske områder i snor / moderkagen prøve. Vi leverer her en systematisk og simpel metode til dissektion af UC, CPJ, og tilsluttet FP til isolering af MSC. Vi viser også en omfattende og simpel protokol til at karakterisere og vurdere kvaliteten af de isolerede celler ved at bestemme deres spredning capabilteter, såvel som deres selvfornyelse og differentiering potentialer. Denne metode er reproducerbar og giver en stor mængde af fineste kvalitet MSC'er.
Vi fandt, at den delvise fordøjelse af vævsstykker 1-2 mm i størrelse under anvendelse af en kommerciel trypsinopløsning reproducerbart gav celler fra eksplantaterne, hvorimod fuldstændig fordøjelse af væv i enkelte celler havde dårlige udbytter af isolerede celler. Men en undersøgelse rapporteret, at større vævseksplantater af UC ca. 10 mm i størrelse var optimal for celleisolering 30. Omvendt anden undersøgelse foreslog, at vævseksplantatet metode resulterede i en længere kultur cyklus og lavere udbytte af celler sammenlignet med enzymet fordøjelsesmetoden 31. I tidligere beretninger, behandling af ledningen væv med collagenase II og hyaluronidase, separat eller efter trypsin, er blevet udført for at isolere ledningen celler 32, 33 <sup> 34. Ikke alene er der en stor variation i fordøjelse metoder ledningen væv før dyrkning, men også de isolerede celler syntes at være heterogen. Brug af skrappe enzymer i længere tidsperioder kan forringe cellemembranen, påvirker celleadhærens og proliferation. Resultaterne af denne metode viser, at delvist fordøjede perinatale vævseksplantater billede udvækst af celler uden at forårsage omfattende cellebeskadigelse, vedligeholdes levedygtighed og gav højere mængder af homogene populationer af MSC'er.
Mens protokollen for dissektion og isolering af celler fra eksplantaterne er ligetil, kan nogle af trinnene vise sig at være en udfordring. Først sikre eksplantat vedhæftning ved at lade deres fastgørelse til overfladen af dyrkningskolben. Dette kan lettes ved anvendelse af en lille mængde medium, der dækker henholdsvis de vævsstykker for de første 2 timer af kultur, og derefter forsigtigt at tilsætte det resterende medium. Second, begrænse antallet af eksplantater til mindre end 15 per T75 kolbe. For lidt plads mellem stykkerne eller for mange styk pr kolbe er hæmmende for celleudgroning. Tredje, vævsstykker, der ikke klæber til overfladen af dyrkningskolben efter 3 dages inkubation bør overføres til en ny kolbe i adhærens og dyrkning. Fjerde, vævsstykker dyrkes bør være fri for cellerester, som inhiberer binding. Femte, dyrkning af store stykker kræver mere medium og forbedrer ikke celleudvækst effektivitet. Endelig overvåge eksplantatkulturer nøje, navnlig efter fremkomsten af celleudvækst, når cellerne hurtigt kan blive sammenflydende og differentiere afhængigt af vævskilde. Nogle få begrænsninger i teknikken indbefatter en manglende ekspertise i dissekering prøverne at adskille CL, WJ, CPJ, og FP; en lille prøvestørrelse, hvilket resulterer i lav WJ udbytte; og forsinkede forarbejdning-prøverne, der skal behandles inden 2-4 timer for indsamling til avoid et tab i celleindvinding.
Den gyldne standard for karakterisering af MSC'er er evnen til at klæbe til plast, danner fibroblastfænotype, og differentierer til flere slægter. Disse er også almindeligt anvendte kriterier til bestemmelse MSC'er som beskrevet af ISCT 35. I denne undersøgelse celler isoleret fra alle fire kilder adhærerede til plast og havde positivt udtryk for MSC-markører (CD29, CD44, CD73, CD90, og CD105), men negative udtryk for den hæmatopoietiske markør CD45. Desuden udtrykte de humane leukocyt-antigen (HLA) klasse I, men var negative for HLA-klasse II. Sammenlignet med BM-MSC'er, WJ- og CPJ-afledte celler var højere. Disse resultater stemmer overens med de foregående rapporter i UC MSC'er 33, 36, 37, 38. Desuden viste vores resultater, CL-, WJ-, CPJ-, FP-MSC'er udtrykte tværnationalepotens gener, såsom OCT4, NANOG, og SOX2; Men deres udtryk var lavere end for økonomiske og sociale råd, som tidligere 39 rapporteret. Disse resultater var også i overensstemmelse med en tidligere undersøgelse, som rapporterede ekspressionen af pluripotensmarkør i perinatale afledte celler 40. Interessant nok blev det observeret, at ekspressionen af pluripotente markør var højere i CPJ-MSC'er end i celler isoleret fra andre kilder. Det blev også bemærket, at UC-MSC'erne udstillet større selvfornyelse potentiale end BM-MSC 41. Interessant nok til trods for ligheden i fænotypiske karakteristika, de celler isoleret fra de fire kilder havde variable CFE-værdier. Men bortset fra FP-MSC, de alle havde bedre CFE værdier end BM-MSC. CPJ-MSC havde den højeste CFE værdi og hastigheden af spredning i forhold til alle andre MSC. Desuden WJ- og CPJ-MSC'er viste højere differentieringsfaktorer potentialer end BM-MSC'er. CL-MSC'er udviste den mindste differentieringpotentiale i alle tre slægter (dvs. adipogeniske, chondrogene og osteogene), hvorimod CPJ-MSC havde den højeste trilineage differentiering potentiale og FP-MSC viste den mindste adipogenisk differentiering potentiale.
Afslutningsvis viste vores resultater, at kvaliteten og kvantiteten af isolerede MSC afveg mellem de fire kilder i ledningen / moderkagen prøve. CPJ-MSC havde mere spredning kapacitet og større selvfornyelse potentiale. De var også potente i deres differentiering i trilineage celletyper. Grund af deres lave fordoblingstid kunne CPJ-MSC'er være hurtigt udvidet 1000 gange og anvendes til high-throughput lægemiddel eller biomateriale screening. Disse celler kunne være en mere lovende kilde til celleterapi og regenerativ medicin applikationer.
The authors have nothing to disclose.
Undersøgelsen blev støttet af OU-WB ISCRM, Oakland University og Michigan hoved og Spine Institute. N. Beeravolu og C. McKee modtaget Provost Graduate Research Award fra Oakland University. Vi sætter pris på S. Bakshi for revision af manuskriptet.
DMEM with 4500 mg/ml glucose | Invitrogen | 11995065 | |
FBS | Aleken Biologicals | FBSS500 | |
Isobutyl-methylxanthine | Sigma | I5879-250mg | |
Dexamethasone | Sigma | D4902-100mg | |
Insulin | Prospec | CYT-270 | |
Indomethacin | Sigma | I7378-5G | |
TGFβ1 | Prospec | CYT-716 | |
Ascorbic acid | Sigma | A-7631 | |
Ascorbate 2-phosphate | Sigma | A-8960 | |
β-glycerophosphate | Sigma | G-6251 | |
TrypLE | Invitrogen | 50591419 | |
GeneJET RNA purification kit | Thermo Scientific | K0732 | |
DNase | Promega | M6101 | |
iScript kit | Biorad | 1708891 | |
Sso-Advanced Universal SYBR Green Supermix Kit | Biorad | 1725274 | |
4% paraformaldehyde | Affymetrix | 19943 | |
OCT | Thermo Scientific | SH75-125D | |
Oil Red O | American MasterTech Scientific | STORO100 | |
Toluidine blue | Thermo Scientific | S71363 | |
Crystal violet | Sigma | C3886 | |
Alizarin red stain | Thermo Scientific | S25131 | |
APC Mouse anti-Human CD29 | BD Biosciences | 559883 | |
APC Mouse anti-Human CD34 | BD Biosciences | 555824 | |
FITC Mouse anti-Human CD44 | BD Biosciences | 555478 | |
FITC Mouse anti-Human CD45 | BD Biosciences | 555482 | |
APC Mouse anti-Human CD73 | BD Biosciences | 560847 | |
FITC Mouse anti-Human CD90 | BD Biosciences | 561969 | |
APC Mouse anti-Human CD105 | BD Biosciences | 562408 | |
Centrifuge | IEC | 93522M-2 | |
CO2 incubator | Thermo Scientific | Hera Cell 150i | |
Light microscope (LM) | Nikon Instruments Inc. | Olympus | |
Hemacytometer | Thermo Scientific | 0267151B | |
Cryostat | Leica | CM3050 S | |
FACS Canto II and Diva Software | BD Biosciences | Canto II | |
Thermocycler | MJ Research Inc. | PTC-100 | |
Real-Time PCR System | Bio-Rad | CFX96 |