Här presenterar vi ett protokoll för dissektion av human navelsträng (UC) och fetal placenta provet i sladden belägget (CL), Wharton s gelé (WJ), sladd-placenta-övergång (CPJ), och fetal placenta (FP) för isolering och karaktärisering av mesenkymala stromaceller (MSC) med användning explantatet odlingstekniken.
Den mänskliga navelsträngen (UC) och placenta är icke-invasiva, primitiva och rikliga källor till mesenkymala stromaceller (MSC) som alltmer har fått uppmärksamhet eftersom de inte utgör någon etiska eller moraliska betänkligheter. Nuvarande metoder för att isolera MSC: er från UC ge låga mängder av celler med variabel spridningspotentialer. Eftersom UC är en anatomiskt-komplext organ, kan skillnader i MSC egenskaper bero på skillnaderna i de anatomiska regioner i deras isolering. I denna studie, första dissekerade vi de sladd / placenta proverna i tre diskreta anatomiska regioner: UC, sladd-placenta junction (CPJ), och fetal placenta (FP). Andra, två distinkta zoner, sladd foder (CL) och Wharton gelé (WJ), separerades. Explantatet odlingstekniken användes sedan för att isolera celler från de fyra källor. Den tid som krävs för den primära kulturen av celler från explantaten varieras beroende på källan för vävnaden. Utväxt av cellerna skedde inom 3 – 4 days av CPJ explantat, medan tillväxt observerades efter 7 – 10 dagar och 11 – 14 dagar från CL / WJ och FP explantat, respektive. De isolerade cellerna var vidhäftande till plast och visas fibroblastoid morfologi och ytmarkörer, såsom CD29, CD44, CD73, CD90, och CD105, på liknande sätt som benmärgen (BM) -härledda MSCs. Emellertid den kolonibildande effektiviteten hos cellerna varierade, med CPJ-MSC: er och WJ-MSC: er som visar högre verkningsgrad än BM-MSC: er. MSCs från alla fyra källor differentieras till adipogena, kondrogena och osteogena linjer, vilket indikerar att de var multi. CPJ-MSCs differentierade mer effektivt i jämförelse med andra MSC källor. Dessa resultat antyder att CPJ är den mest potenta anatomiska regionen och ger ett högre antal celler, med större spridning och självförnyelsekapaciteten in vitro. Avslutningsvis, den jämförande analysen av MSCs från de fyra källorna indikerade att CPJ är ett mer lovande källa till MSC-celler för cellterapi, regenerativemedicine, och vävnadsteknik.
Stamceller är närvarande i olika organ och vävnader i kroppen. De har regenerativ potential och spelar en viktig roll i att reparera skadade vävnader i kroppen under loppet av mänskligt liv 1, 2. Detta har genererat ett stort intresse hos vuxna stamceller (ASC), särskilt eftersom, till skillnad från embryonala stamceller (ESC), har användningen av ASC: er inte utgör moraliska och etiska dilemman. Flera studier har rapporterat isoleringen av ASC: er, såsom mesenkymala stromaceller (MSC); hematopoetiska stamceller (HSCs); och olika progenitorer, inklusive olika vuxna källor sträcker sig från benmärg (BM) till fettvävnad (AT) och tandpulpa 3, 4, 5. Emellertid antalet ASC: er som finns i de flesta av de vuxna nischer är begränsad, och deras isolering i allmänhet innebär en invasiv och smärtsam procedur med möjlig donatorsite sjuklighet. Dessutom kunde donator ålder och miljöstress också spela en viktig roll vid bestämning av kvaliteten och den biologiska aktiviteten hos de isolerade cellerna 6, 7, 8. ASC visar också begränsad proliferation och differentiering potential under odling in vitro.
För att övervinna dessa nackdelar med nuvarande DSK har nya källor bedrivits för att isolera stamceller. Dessa ansträngningar har lett till isolering av stamceller från perinatala källor, inklusive navelsträngsblod, sladd vävnad, placenta och fostervatten 9. Dessa källor har fått uppmärksamhet på grund av deras lätt och riklig tillgång 10, 11, 12, 13. Dessutom kan perinatala vävnader erhållas icke-invasivt, och stamceller som härrör från dem ärmer primitiva än ASCs isolerade från vuxna källorna 14, 15. De är isolerade från vävnader erhållna vid födseln och anses ha genomgått minimala förändringar i genomet på grund av åldrande och miljöspänningar 16.
Men de rapporterade egenskaperna hos stamceller från perinatala källor och deras möjligheter att själv förnya samt att skilja varierar kraftigt 11, 17. Detta skulle kunna vara delvis beroende på det faktum att det mänskliga navelsträngen (UC) är en komplext organ. Vår hypotes är att de diskreta regionerna perinatal vävnad skapa specifika nischer som är ansvariga för de variationer och mer primitiva arten av dessa stamceller i jämförelse med DSK: er som härrör från icke-perinatala källor. Denna studie beskriver dissektion av sladden / placenta proverna i tre diskreta anatomiska regioner: UC, sladd-placenta junction (CPJ), end fetal placenta (FP). UC ades vidare dissekeras i två zoner: sladd foder (CL) och Wharton Jelly (WJ). Analys av de isolerade celler från CL, WJ, CPJ, och FP visat att de alla uppvisade fibroblastoid morfologi och uttryckte MSC markörer, men de skilde sig i sin självförnyelse och differentiering potential. CPJ-härledda celler uppvisade en högre frekvens av proliferation och självförnyelse potential jämfört med UC-och FP-härledda celler, vilket gör dem en mer lovande källa för cellterapi, regenerativ medicin, och vävnadsteknik.
Senaste framstegen inom forskning på stamceller inte bara förbättrat förståelsen för grundläggande utvecklingsprocesser utan också tillgänglig lovande möjligheter för användningen av stamceller i biotekniska, farmaceutiska, cellterapi, regenerativ medicin, och vävnadskonstruktionsapplikationer 18, 19, 20. Medan pluripotenta ekonomiska och sociala råd som isolerats från tidiga embryon är den mest lovande, möter de tekniska utmaningar och etiska dilemman 21, 22, 23. Inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) härledda från vuxna celler tillhandahålla ett alternativ, men de också möter liknande tekniska och säkerhetsproblem 23. Vidare kan iPSCs inte vara genetiskt stabila eller kan ha genomgått genetiska förändringar, vilket begränsar deras terapeutiska användning. Stamceller har också rapporterats i en mängd olika postnatal tisstämmer och organ. De vanligaste källorna till dessa DSK: er är benmärgen, fett och muskelvävnad. Emellertid har ASC från postnatal källor begränsad tillväxt och differentiering potential 24, 25. De lider också på grund av åldrande och exponering för miljöpåfrestningar och därmed är inte alltid effektiva för terapeutiska tillämpningar 26, 27, 28. Detta har lett oss och andra för att söka efter nya källor till stamceller som är mer naiv än ASCs.
Vi har undersökt perinatala källor för primitiva stamceller som ett alternativ till DSK: er. I denna rapport ger vi en pålitlig, robust och enkel metod för att isolera humana MSCs från sladden / placenta prover. I jämförelse med andra källor och metoder som används för isolering av ASC: er, ger denna metod en effektiv och icke-invasiv metod för att isolera stora mängder av high-kvalitet MSCs. Det accentuerar ytterligare högre tillväxt och differentieringspotential av perinatala MSCs jämfört med MSC: er från vuxna källor såsom BM.
UC fästa fostret för moderkakan är en stor orgel med distinkta anatomiska regioner, inklusive två artärer, en ven, CL, och WJ (vävnad som omger blodkärlen). Flera studier har rapporterat isolering av MSC-celler från hela sladd, WJ, eller moderkakan, med variabel tillväxt och differentiering potentialer 25, 29. Icke desto mindre, till dags dato, ingen studie har effektivt undersökas och jämförde celler från olika anatomiska regioner i sladden / placenta prov. Vi ger här en systematisk och enkel metod för dissektion av UC, CPJ, och anslutna FP för isolering av MSC. Vi visar också en omfattande och enkelt protokoll för att karakterisera och utvärdera kvaliteten på de isolerade cellerna genom att bestämma deras spridning capabilheterna, samt deras självförnyelse och differentiering potential. Denna metod är reproducerbar och ger en stor mängd av överlägsen kvalitet MSCs.
Vi fann att den partiella digerering av vävnadsbitar 1-2 mm i storlek med användning av en kommersiell trypsinlösning reproducerbart gav cellerna från explantaten, medan fullständig spjälkning av vävnad i enstaka celler hade dåliga utbyten av isolerade celler. Emellertid rapporterade en studie att större vävnads explantat av UC ungefär 10 mm i storlek var optimala för cellisolering 30. Omvänt, föreslog en annan studie att vävnadsexplantat metod resulterade i en längre odlingscykel och lägre utbyte av celler jämfört med den enzymdigeremetoden 31. I tidigare rapporter, behandlingen av sladden vävnader med kollagenas II och hyaluronidas, separat eller efter trypsin, har utförts för att isolera sladd celler 32, 33 <sup>, 34. Inte bara är det en hel del variation i uppslutningsmetoder sladden vävnaden före odling, utan även de isolerade cellerna tycktes vara heterogena. Användning av starka enzymer under längre tidsperioder kan försämra cellmembranet, som påverkar cellvidhäftning och proliferation. Resultaten av denna metod visade att partiellt digere perinatala vävnadsexplantat tillgänglig utväxt av celler utan att orsaka omfattande cellskada, underhålls viabilitet, och gav högre mängder av homogena populationer av MSCs.
Medan protokollet för dissekering och isolering av celler från explantaten är enkel, kan en del av de åtgärder som visar sig vara en utmaning. Först, se till explantat vidhäftning genom att tillåta deras fastsättning till ytan av odlingskolven. Detta kan underlättas genom användning av en liten mängd medium, endast täcker vävnaden bitar för de första 2 h av odling, och sedan försiktigt tillsätta det kvarvarande mediumet. Second, begränsa antalet explantat till mindre än 15 per T75-kolv. För lite utrymme mellan styckena eller alltför många bitar per kolv är inhibitoriska för cellutväxt. Tredje, vävnadsbitar som inte fastnar på ytan av odlingskolven efter 3 dagars inkubation ska överföras till en ny kolv för vidhäftning och odling. Fjärde, bitar vävnad odlas bör vara fri från cellfragment, som hämmar fastsättning. Femte, odling av stora bitar kräver mer medium och förbättrar inte cell utväxt effektivitet. Slutligen, övervaka explantatodlingarna noggrant, i synnerhet efter det att utseendet på cellutväxt, eftersom cellerna snabbt kan bli sammanflytande och differentiera beroende på vävnadskällan. Några begränsningar av tekniken inkluderar en brist på expertis i dissekera proven att separera CL, WJ, CPJ, och FP; en liten provstorlek, vilket resulterar i låg WJ utbyte; och fördröjda behandlings-proverna måste bearbetas inom 2-4 h från insamling till avoid en förlust i cellutvinning.
Den gyllene standarden för karakterisering av MSCs är förmågan att vidhäfta till plast, bilda den fibroblastisk fenotyp, och differentierar till flera härstamningar. Dessa är också ofta använda kriterier för att definiera MSCs såsom beskrivs av ISCT 35. I denna studie celler som isolerats från alla fyra källor var anhängare till plast och hade positivt uttryck för MSC-markörer (CD29, CD44, CD73, CD90 och CD105) men negativ uttryck för hematopoetisk markören CD45. Dessutom uttryckte de humana leukocytantigen (HLA) klass I men var negativa för HLA klass II. Jämfört med BM-MSC: er, WJ- och CPJ-härledda celler var högre. Dessa resultat överensstämmer med de tidigare rapporterna från UC-härledda MSCs 33, 36, 37, 38. Dessutom har våra resultat visade att CL-, WJ-, CPJ-, FP-MSCs uttryckte mångpotens gener såsom OCT4, NANOG, och SOX2; Men deras uttryck var lägre än för ekonomiska och sociala råd, som tidigare 39 rapporterats. Dessa resultat var också överens med en tidigare studie som rapporterade ett uttryck för pluripotens markörer i perinatala-härledda celler 40. Interestingly, observerades det att uttrycket av pluripotenta markör var högre i CPJ-MSC: er än i celler som isolerats från andra källor. Det var också märkt att UC-MSCs uppvisade större självförnyelse potential än BM-MSC 41. Interestingly, trots likheten i fenotypiska egenskaper, de celler som isolerats från de fyra källorna hade variabla CFE-värden. Med undantag för FP-MSC, hade de alla bättre CFE värden än BM-MSC. CPJ-MSC hade den högsta CFE värdet och graden av proliferation jämfört med alla andra MSC. Dessutom WJ- och CPJ-MSC: er som visas högre differentieringspotentialer än BM-MSC: er. CL-MSCs visade den minsta differentieringpotential i alla tre linjer (dvs adipogena, kondrogena och osteogena), medan CPJ-MSC hade den högsta trilineage differentieringspotential och FP-MSCs visade minst adipogena differentieringspotential.
Sammanfattningsvis våra resultat visade att kvaliteten och kvantiteten av isolerade MSC skilde mellan de fyra källor i sladden / placenta prov. CPJ-MSC hade mer spridning kapacitet och högre självförnyelse potential. De var också potenta i deras differentiering till typerna trilineage cell. Grund av deras låga dubbleringstid, kunde CPJ-MSC: er vara snabbt expanderade 1000-faldigt och användes för hög genomströmning läkemedel eller biomaterial screening. Dessa celler kan vara mer lovande källa för cellterapi och regenerativ medicin applikationer.
The authors have nothing to disclose.
Studien stöddes av OU-WB ISCRM, Oakland University och Michigan huvud och Spine Institute. N. Beeravolu och C. McKee fick Provost Graduate Research Award från Oakland University. Vi uppskattar S. Bakshi för att granska manuskriptet.
DMEM with 4500 mg/ml glucose | Invitrogen | 11995065 | |
FBS | Aleken Biologicals | FBSS500 | |
Isobutyl-methylxanthine | Sigma | I5879-250mg | |
Dexamethasone | Sigma | D4902-100mg | |
Insulin | Prospec | CYT-270 | |
Indomethacin | Sigma | I7378-5G | |
TGFβ1 | Prospec | CYT-716 | |
Ascorbic acid | Sigma | A-7631 | |
Ascorbate 2-phosphate | Sigma | A-8960 | |
β-glycerophosphate | Sigma | G-6251 | |
TrypLE | Invitrogen | 50591419 | |
GeneJET RNA purification kit | Thermo Scientific | K0732 | |
DNase | Promega | M6101 | |
iScript kit | Biorad | 1708891 | |
Sso-Advanced Universal SYBR Green Supermix Kit | Biorad | 1725274 | |
4% paraformaldehyde | Affymetrix | 19943 | |
OCT | Thermo Scientific | SH75-125D | |
Oil Red O | American MasterTech Scientific | STORO100 | |
Toluidine blue | Thermo Scientific | S71363 | |
Crystal violet | Sigma | C3886 | |
Alizarin red stain | Thermo Scientific | S25131 | |
APC Mouse anti-Human CD29 | BD Biosciences | 559883 | |
APC Mouse anti-Human CD34 | BD Biosciences | 555824 | |
FITC Mouse anti-Human CD44 | BD Biosciences | 555478 | |
FITC Mouse anti-Human CD45 | BD Biosciences | 555482 | |
APC Mouse anti-Human CD73 | BD Biosciences | 560847 | |
FITC Mouse anti-Human CD90 | BD Biosciences | 561969 | |
APC Mouse anti-Human CD105 | BD Biosciences | 562408 | |
Centrifuge | IEC | 93522M-2 | |
CO2 incubator | Thermo Scientific | Hera Cell 150i | |
Light microscope (LM) | Nikon Instruments Inc. | Olympus | |
Hemacytometer | Thermo Scientific | 0267151B | |
Cryostat | Leica | CM3050 S | |
FACS Canto II and Diva Software | BD Biosciences | Canto II | |
Thermocycler | MJ Research Inc. | PTC-100 | |
Real-Time PCR System | Bio-Rad | CFX96 |