La reconstitución de los nucleosomas con histonas hermanas marcadas con isótopos diferencialmente
Summary
Este protocolo describe la reconstitución de los nucleosomas que contienen histonas hermana marcados con isótopos diferencialmente. Al mismo tiempo, los nucleosomas asimétricamente después de la traducción modificados pueden ser generados después de usar una copia de la histona premodified. Estas preparaciones se pueden utilizar fácilmente para estudiar los mecanismos de modificación de diafonía, simultáneamente en ambos histonas hermanas, mediante el uso de la espectroscopia de RMN de alta resolución.
Abstract
nucleosomas asimétricamente modificados contienen las dos copias de una histona (histonas hermana) decoradas con distintos conjuntos de modificaciones post-traduccionales (PTMs). Son especies recién identificadas con medios desconocidos de establecimiento y consecuencias funcionales. métodos analíticos actuales son insuficientes para detectar la aparición-copia específica del PTM de las histonas del nucleosoma hermanas. Este protocolo presenta un método bioquímico para la reconstitución in vitro de los nucleosomas que contienen histonas hermanas marcados con isótopos diferencialmente. El complejo generada puede ser también modificado de forma asimétrica, después de que incluye una piscina de histonas premodified durante el replegamiento de Subcomplejos histonas. Estas preparaciones de nucleosomas asimétricos pueden ser fácilmente reaccionar con enzimas modificadoras de histonas para estudiar los mecanismos de modificación de diafonía impuestas por el PTM asimétricamente pre-constituida mediante espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN). En particular, las reacciones de modificación enEn tiempo real se puede asignar de forma independiente en los dos histonas hermanas mediante la realización de diferentes tipos de experimentos de correlación de RMN, adaptados para el tipo de isótopo. Esta metodología proporciona los medios para estudiar los mecanismos de diafonía que contribuyen a la formación y propagación de los patrones de PTM asimétricos en complejos nucleosomal.
Introduction
DNA eucariótico está estrechamente empaquetados dentro de los núcleos celulares en la cromatina. El bloque de construcción fundamental de la cromatina es la partícula de núcleo nucleosoma que contiene ~ 147 pb de ADN envuelto alrededor de un complejo de octameric formado por dos copias de cada uno de los cuatro histonas del núcleo (H3, H4, H2A, H2B). Las proteínas histonas albergan una gran cantidad de modificaciones post-traduccionales (PTMs). Estas sustituciones covalentes inducen alteraciones en la estructura de la cromatina, tanto directamente al afectar a la química física del sistema e indirectamente mediante el reclutamiento de las actividades de remodelación de la cromatina 1, 2, 3. Por estos medios, PTMs histonas controlan la accesibilidad de la cromatina y, por lo tanto, regular todas las funciones celulares 4 basadas en ADN.
Las PTM se instalan de sistemas de enzimas modificadoras de histonas, principalmente en los segmentos N-terminal no estructurados (colas) de histo-nucleosoma incorporadones. Debido a los muchos sitios de modificación en la relativamente corta secuencia de las colas de las histonas, PTM influyen entre sí mediante la inducción o el bloqueo de reacciones de modificación posteriores, un efecto conocido como modificación de la diafonía 5. Debido a la arquitectura simétrica global del nucleosoma, se pensaba que reacciones de modificación y mecanismos de diafonía que se produzca de manera similar en las dos copias de cada histona nucleosomal (histonas hermana). Este concepto ha sido recientemente cuestionado y posteriormente refutada. En particular, los ensayos enzimáticos in vitro sobre las histonas H3 libre de péptidos de la cola y en nucleosomas demostraron que un conjunto de quinasas H3 fosforilación introdujo de forma asimétrica 6. Además, el análisis LC-MS / MS basados en purificación por afinidad reveló la existencia de nucleosomas asimétricamente H3-metilado en varios tipos de células eucariotas 7. Por lo tanto, los nucleosomas modificados de forma asimétrica constituyen nuevas especies, ySe necesitan herramientas para descubrir los mecanismos que controlan su formación y para analizar los efectos de diafonía que esta asimetría podría ejercer.
Comúnmente, Western Blotting (WB) y el análisis de espectrometría de masas (MS) se han utilizado para detectar PTM histonas. A pesar de su fácil aplicación, WB sufre de problemas de especificidad / reactividad cruzada. Además de eso, es incapaz de realizar simultáneamente el análisis multi-PTM y cuantificación directa de las reacciones de modificación 8. Por otro lado, el análisis de MS emplea instrumentación sofisticada que requiere una formación de alto nivel, sino que proporciona una alta especificidad, así como la cartografía y cuantificación simultánea de múltiples PTM 9. Sin embargo, ambos métodos son perjudiciales y los complejos se disocian nucleosomal antes del análisis, dando lugar a una mezcla de histonas y / o péptidos de histona-derivado. Esta manipulación elimina la capacidad de distinguir independientereacciones de modificación que se producen en cada una de las dos hermanas histonas y para informar sobre el estado de variación de la copia específica de las histonas del nucleosoma.
espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) desarrollado como un método alternativo para asignar reacciones PTM. NMR es sin interrupciones y por lo tanto permite el seguimiento de eventos PTM de una manera en tiempo real en las mezclas reconstituidas, e incluso en células intactas 10, 11. El desarrollo de las rutinas para la adquisición rápida de datos, así como para la cartografía de alta resolución basado en 2D métodos de correlación hetero-nuclear de muestras marcados con isótopos (15 N y / o 13 C) 12 permitió el mapeo simultánea de diferentes tipos de PTM, tales como serina / treonina / tirosina fosforilación, acetilación de lisina / metilación, y la metilación de arginina 13. Dependiendo de la PTM bajo investigación, 15 N- o C-13 etiquetado protocols se pueden emplear para marcar el grupo funcional de proteína que sirve como un reportero de modificación. En consecuencia, PTM cartografía puede llevarse a cabo siguiendo la característica de desplazamiento del desplazamiento químico del grupo funcional correspondiente 'detección' la alteración en el ambiente químico. En la mayoría de los casos, tanto grupos químicos CH NH y se pueden utilizar para informar de la evolución de la PTM de interés.
El protocolo actual describe la generación de nucleosomas que contienen histonas hermanas marcados con isótopos diferencialmente. Se combina la flexibilidad de la espectroscopía de RMN a mapa PTM utilizando tanto 1 H- 15 N y 1 H- 13 C espectros de correlación con la utilización de diferentes etiquetas de afinidad para la purificación de proteínas de los complejos histona reconstituidas seleccionados. En particular, el protocolo emplea dos piscinas diferentes de una histona particular para la reconstitución nucleosoma. Estas piscinas son diferencialmente marcado con isótopos (uno con <sup> 15 N, el otro con 13 C), y se fusiona a una de polihistidina y una etiqueta de afinidad de estreptavidina, respectivamente. Un esquema de purificación por afinidad en tándem con Ni-NTA y cromatografía a base de estreptavidina utilizado inicialmente por Voigt et al. 7 se emplea para purificar especies asimétrica de homólogos simétricos (Figura 1A). Octámeros histonas asimétricas se utilizan posteriormente para reconstituir los complejos nucleosomal equivalentes (Figura 1b), utilizando el método de diálisis de sal estándar 14. Además, por el mismo procedimiento y por tener una de las piscinas histonas pre-modificado, un PTM puede ser incorporado de forma asimétrica en los nucleosomas resultantes. La reacción de estos sustratos con enzimas modificadoras de histonas y la posterior RMN-mapeo de eventos de modificación permite la caracterización de los mecanismos de diafonía tanto en cis (premodified copia de histonas) y en trans (unmodified copia de histonas) (Figura 1C).
Protocol
Representative Results
Discussion
Para la reconstitución de nucleosomas, el protocolo actual utiliza un molde de ADN largo de 165 pb que contenía la secuencia de posicionamiento de nucleosomas 601-Widom 20, pero un rendimiento similar se espera que el uso de diferentes longitudes de moldes de ADN. El protocolo fue diseñado y emplea el uso de tipos asimétricas de la histona H3. Con el mismo principio, el método se puede aplicar también para los otros histonas del núcleo y, además, puede ser utilizado para reconstituir los …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El Dr. Philipp Selenko (FMP-Berlín) autor agradece a proporcionar un espacio laboratorio húmedo y la infraestructura para llevar a cabo experimentos y Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) para financiar el trabajo a través de una beca de investigación (LI 2402 / 2-1).
Materials
| Unfolding Buffer | 7M guanidinium HCl | ||
| 20mM Tris pH7.5 | |||
| 10mM DTT | |||
| Refolding Buffer | 10mM Tris pH7.5 | ||
| 2M NaCl | |||
| 1mM EDTA | |||
| 2mM DTT | |||
| Assay Buffer | 25mM NaxHxPO4 pH6.8 | ||
| 25mM NaCl | |||
| 2mM DTT | |||
| Guanidinium HCl | Applichem | A14199 | Use high quality Gu-HCl |
| Tris | Roth | 4855.2 | |
| DTT | Applichem | A1101 | |
| NaCl | VWR chemicals | 27810.364 | |
| EDTA | Roth | 8043.2 | |
| Na2HPO4 | Applichem | A1046 | |
| NaH2PO4 | Applichem | A3902 | |
| Imidazole | Applichem | A1073 | |
| d-Desthiobiotin | Sigma | D1411 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 1034557 | |
| Strep-Tactin Superflow | IBA | 2-1207-001 | |
| His-probe antibody | Santa Cruz | sc-8036 | |
| Strep-tactin conjugated HRP | IBA | 2-1502-001 | |
| Hi-Load 16/600 Superdex 200pg | GE Healthcare | 28-9893-35 | |
| 6-8kDa dialysis membrane | Spectrumlabs | spectra/por 1, 132650 | |
| 50kDa dialysis membrane | Spectrumlabs | spectra/por 7, 132129 | |
| 10kDa centrigugal filter unit | Merck Millipore | UFC901024 | |
| 30kDa centrigugal filter unit | Merck Millipore | UFC903024 | |
| Solution-state NMR spectrometer | at least 500 MHz operating frequency, equipped with a triple-resonance cryoprobe |
Referências
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