ऊतक विशेष बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) सेल समारोह की एक प्रमुख मध्यस्थ है। यह लेख शुद्ध ईसीएम व्युत्पन्न फोम और microcarriers कि इन विट्रो सेल संस्कृति मॉडल में उन्नत 3 डी में अनुप्रयोगों के लिए या समर्थक पुनर्योजी bioscaffolds के रूप में रासायनिक तिर्यक की आवश्यकता के बिना संस्कृति में स्थिर रहे हैं synthesizing के लिए तरीके का वर्णन है।
सेल समारोह बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) है, जो जटिल ऊतक-विशिष्ट संरचना और वास्तुकला है के साथ बातचीत द्वारा मध्यस्थता है। इस लेख का ध्यान केंद्रित विट्रो सेल संस्कृति मॉडल में या ऊतक इंजीनियरिंग और पुनर्योजी चिकित्सा के लिए समर्थक पुनर्योजी scaffolds और सेल वितरण प्रणाली के रूप में उन्नत 3 डी में जैविक रूप से प्रासंगिक substrates के रूप में उपयोग के लिए ईसीएम व्युत्पन्न झरझरा फोम और microcarriers fabricating के लिए तरीकों पर है। एक प्रारंभिक सामग्री के रूप में decellularized ऊतकों या शुद्ध अघुलनशील कोलेजन का उपयोग करना, तकनीक अनुकूलन geometries के साथ ऊतक विशेष bioscaffolds की एक व्यापक श्रेणी के संश्लेषण के लिए लागू किया जा सकता। दृष्टिकोण यांत्रिक प्रसंस्करण और एक ईसीएम निलंबन है कि नियंत्रित ठंड और lyophilization प्रक्रियाओं के माध्यम से तीन आयामी फोम या microcarriers निर्माण किया जाता है उपज के लिए हल्के एंजाइमी पाचन शामिल है। ये शुद्ध ईसीएम व्युत्पन्न scaffolds अत्यधिक झरझरा, फिर भी रासायनिक की आवश्यकता के बिना स्थिर रहे हैंअल एजेंट या अन्य additives कि नकारात्मक कोशिकाओं के कार्य को प्रभावित कर सकता crosslinking। पाड़ गुण ऐसे ईसीएम निलंबन एकाग्रता, यांत्रिक प्रसंस्करण विधियों, या संश्लेषण की स्थिति के रूप में अलग-अलग कारकों से कुछ हद तक नियोजित किया जा सकता। सामान्य तौर पर, मचान मजबूत और संभाल करने के लिए आसान कर रहे हैं, और सबसे मानक जैविक assays के लिए ऊतकों के रूप में संसाधित किया जा सकता, कि देशी ईसीएम रचना की नकल करता एक बहुमुखी और उपयोगकर्ता के अनुकूल 3 डी सेल संस्कृति मंच प्रदान करते हैं। कुल मिलाकर, अनुकूलित ईसीएम व्युत्पन्न फोम और microcarriers fabricating के लिए इन सरल तरीकों दोनों जीव और इन विट्रो के लिए और इन विवो अनुप्रयोगों में ऊतक विशेष सेल शिक्षाप्रद प्लेटफॉर्म के रूप में जैव चिकित्सा इंजीनियरों के हित के लिए हो सकता है।
बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) प्रोटीन, ग्लाइकोप्रोटीन, और पॉलीसैकराइड 1 की एक जटिल 3 डी नेटवर्क के शामिल है। एक बार एक मुख्य रूप से संरचनात्मक ढांचे के रूप में माना, अब यह अच्छी तरह से स्वीकार किया कि ईसीएम महत्वपूर्ण कार्यात्मक भूमिकाओं 2 के साथ जैवसक्रिय अणुओं की एक विविध सरणी को शामिल किया गया है। सेल ईसीएम बातचीत सेल अस्तित्व, आसंजन, प्रवास, प्रसार, और भेदभाव 3 प्रत्यक्ष कर सकते हैं। ईसीएम बड़े अणुओं के प्रमुख वर्गों आम तौर पर अच्छी तरह से ऊतकों और प्रजातियों के संरक्षण कर रहे हैं, प्रत्येक ऊतक एक अनूठा मैट्रिक्स संरचना और वास्तुकला 4 है। कुल मिलाकर, ऊतक विशेष ईसीएम एक शिक्षाप्रद सूक्ष्म पर्यावरण ऊतक / अंग पैमाने से 5 subcellular से समारोह मध्यस्थता करता है कि प्रदान करता है।
सेलुलर समारोह में मध्यस्थता करने में ईसीएम के महत्वपूर्ण भूमिका के कारण, डी में रुचि बढ़ रही हैऊतक इंजीनियरिंग और पुनर्योजी चिकित्सा में अनुप्रयोगों के लिए ईसीएम व्युत्पन्न bioscaffolds की velopment। विशेष रूप से, decellularization की विधि बड़े पैमाने पर ऊतक पुनर्जनन और सेल वितरण 5, 6, 7 के लिए एक मचान सामग्री के रूप में उपयोग के लिए ऊतकों की एक विस्तृत श्रृंखला से ईसीएम प्राप्त करने के साधन के रूप का पता लगाया गया है। Decellularization आम तौर पर, जबकि आदर्श 3 डी संरचना और ईसीएम 8 की रचना करने के लिए कम से कम परिवर्तन के कारण यांत्रिक, रासायनिक, और / या जैविक उपचार चरणों कोशिकाओं और सेलुलर घटकों को दूर करने पर लक्षित की एक श्रृंखला शामिल है,। साहित्य सर्वेक्षण के माध्यम से, विभिन्न decellularization प्रोटोकॉल शरीर 7 में लगभग हर ऊतक के लिए पहचाना जा सकता है।
decellularized ऊतकों प्रत्यारोपण scaffolds या 3 डी सेल संस्कृति substrates के रूप में सीधे इस्तेमाल किया जा सकता है, सेलुलर घुसपैठ कर सकते हैंएक घने ईसीएम संरचना 9 के साथ ऊतकों में सीमित हो। इसके अलावा, ईसीएम में प्राकृतिक विविधता सेल लगाव और decellularized मैट्रिक्स, जो संभवतः सेलुलर प्रतिक्रिया 10 पर प्रभाव पड़ सकता भीतर वितरण में परिवर्तनशीलता हो सकती है। कुल मिलाकर, जबकि कुछ अनुप्रयोगों के लिए वादा किया है, उनके बरकरार रूप में decellularized ऊतकों को लागू करने के आकार, सरंध्रता, और कठोरता सहित ट्यूनिंग पाड़ गुणों के संदर्भ में सीमित बहुमुखी प्रतिभा है, साथ ही इन विवो अनुप्रयोगों के लिए प्रसव के मोड प्रदान करता है।
इन सीमाओं को दरकिनार करने के लिए, कई अनुसंधान समूहों एक आधार सामग्री के रूप decellularized ऊतकों का उपयोग कर अनुकूलित पाड़ स्वरूपों उत्पन्न करने के लिए आगे की प्रक्रिया के तरीकों को लागू करने कर रहे हैं। सरलतम रूप में, इस decellularized ऊतकों cryomilling इंजेक्शन ऊतक विशेष ईसीएम कणों 11 उत्पन्न करने के लिए शामिल हो सकता है। ये ईसीएम कणों को एक सेल वाद्य के रूप में शामिल किया जा सकताजैसे यथास्थान हाइड्रोजेल 12, 13, 14 crosslinking में के रूप में अन्य biomaterials के साथ संयुक्त मचान, में ctive घटक। यांत्रिक प्रसंस्करण के अलावा, decellularized ऊतकों भी 3 डी मुद्रण के लिए प्रोटियोलिटिक और / या ग्लाइकोलाइटिक एंजाइमों ईसीएम व्युत्पन्न हाइड्रोजेल, फोम microcarriers निर्माण करना, और कोटिंग्स 15, 16, 17 के साथ एंजाइमी पाचन, साथ ही के संश्लेषण के लिए bioinks के अधीन किया जा सकता है 18।
ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के अलावा, ईसीएम व्युत्पन्न bioscaffolds जैविक अनुसंधान के लिए इन विट्रो मॉडल में उच्च विश्वस्तता की पीढ़ी के लिए काफी संभावना पकड़ो। एक महत्वपूर्ण 3 डी सेल संस्कृति प्रणाली है कि बेहतर देशी सेलुलर सूक्ष्म पर्यावरण 19 पुनरावृत्ति को विकसित करने की जरूरत है। अधिकांश इन विट्रो गतारीख करने के लिए ell संस्कृति के अध्ययन टिशू कल्चर polystyrene (TCPS) है, जो जैविक रूप से जटिल और गतिशील सेलुलर जीवित ऊतकों 20 के भीतर पाया परिवेश के साथ थोड़ा सहसंबंध है पर आयोजित की जाती हैं। जबकि सेलुलर बातचीत एक नियंत्रित वातावरण के भीतर इन सरलीकृत कठोर 2 डी substrates पर, कोशिकाओं का अध्ययन संवर्धन के लिए सुविधाजनक सेल लगाव और आकृति विज्ञान, साथ ही दोनों कोशिका कोशिका और कोशिका-ईसीएम बदल 21 बातचीत, 22। सेलुलर 2 डी TCPS को मनाया रूपांतरों intracellular संकेत दे रास्ते कि अस्तित्व, प्रसार, प्रवास, और भेदभाव सहित विविध सेल काम करता है, विवो प्रणालियों 23 में मॉडलिंग में 2 डी पढ़ाई की प्रासंगिकता के सवाल उठाये विनियमित प्रभावित कर सकता है। बढ़ता जा रहा मान्यता है कि सेलुलर व्यवहार बनाम 3 डी सिस्टम 24 2 डी में भिन्न हो सकते हैं, और कहा कि जैव रासायनिक और द्वि कर दिया गया हैईसीएम साथ omechanical संकेतन सेल समारोह 25 के प्रमुख मध्यस्थों हैं। कई समूह इस तरह के कोलेजन, laminin, और फाइब्रोनेक्टिन के रूप में ईसीएम घटकों के साथ TCPS कोटिंग द्वारा स्थापित 2 डी सिस्टम की सीमाओं को पार करने का प्रयास किया है। इन रणनीतियों सेल लगाव सुधार कर सकते हैं और सेलुलर प्रतिक्रियाओं को बदल सकता है, इन मॉडलों उनके 2 डी विन्यास है कि जटिल स्थानिक संगठन या देशी ईसीएम 26, 27 के जैव रसायन की नकल नहीं करता है के द्वारा ही सीमित रहते हैं।
हमारे बायोइन्जिनियरिंग प्रयोगशाला 3 डी सेल संस्कृति और ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए substrates के रूप में ईसीएम व्युत्पन्न bioscaffolds के विकास में दिलचस्पी है। विशेष रूप से, हम वसा उत्थान 28 के लिए एक मंच के रूप में मचान (डीएटी) decellularized वसा ऊतकों के उपयोग का बीड़ा उठाया है। इसके अलावा, हम 3 डी microcarriers और झरझरा फोम डी का उपयोग कर synthesizing के लिए तरीकों की स्थापना की हैएटी प्रोटियोलिटिक एंजाइम पेप्सिन या ग्लाइकोलाइटिक एंजाइम के साथ पचा α-amylase 29, 30, 31। विशेष रूप से, हम इन पाड़ प्रारूपों कि वसा व्युत्पन्न ईसीएम संस्कृति में मानव वसा व्युत्पन्न स्टेम / stromal कोशिकाओं (ASCs) की adipogenic भेदभाव के लिए एक आगमनात्मक सूक्ष्म पर्यावरण प्रदान करता है के सभी भर में प्रदर्शन किया है। हाल ही में, हम अपने निर्माण के तरीकों बढ़ाया decellularized बाएं वेंट्रिकल (dlv) α-amylase-पचा सुअर से 3 डी झरझरा फोम उत्पन्न करने के लिए (decellularization तरीकों वेनराइट एट अल से अनुकूलित। 32), और पता चला है कि वे जल्दी cardiomyogenic उत्प्रेरण के लिए एक सहायक मंच प्रदान मानव पेरिकार्डियल वसा व्युत्पन्न ASCs 31 में मार्कर अभिव्यक्ति।
इस लेख का विस्तार से वर्णन गैर रासायनिक तिर्यक 3D झरझरा फोम और microcarriers विशुद्ध रूप से ली गई synthesizing के लिए तरीकेसे इन विट्रो सेल संस्कृति substrates में जैविक रूप से जटिल 3 डी के रूप में उपयोग के लिए और ऊतक पुनर्जनन के लिए biomaterials के रूप में α-amylase-पचा ईसीएम। सिद्धांत रूप में, किसी भी ईसीएम उच्च आणविक भार कोलेजन युक्त स्रोत इन तकनीकों के लिए प्रारंभ माल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। , सुअर decellularized त्वचीय ऊतक (डीडीटी) 8, और प्रतिनिधि उदाहरण के रूप में सुअर dlv इस दृष्टिकोण के लचीलेपन का प्रदर्शन करने के लिए, तरीकों मानव डैट का उपयोग कर ऊतक विशेष bioscaffolds उत्पन्न करने के लिए लागू किया गया है। चित्रा 1 ईसीएम व्युत्पन्न फोम और microcarriers के लिए निर्माण की प्रक्रिया का एक दृश्य अवलोकन प्रदान करता है।
चित्रा ऊतक विशेष ईसीएम व्युत्पन्न foams और Microcarriers के उत्पादन के लिए विधि की 1. अवलोकन। 1. decellularized ऊतकों, के बाद स्थापित तैयार decellularization प्रोटोकॉल, ऊतक विशेष ईसीएम व्युत्पन्न bioscaffold निर्माण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। स्थूल छवियों 2010 32 हाइड्रेटेड मानव डैट के दिखाए जाते हैं, सुअर डीडीटी (फ्लिन 2010 28 में वर्णित के रूप में तैयार) (Reing, जेई, एट अल में वर्णित के रूप तैयार किया। 2010 8), और सुअर dlv (वेनराइट एट अल में वर्णित के रूप तैयार किया। ), ईसीएम सूत्रों के प्रतिनिधि उदाहरण है कि प्रारंभिक सामग्री के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। स्केल सलाखों 3 सेमी प्रतिनिधित्व करते हैं। 2. decellularized ऊतकों lyophilized कर रहे हैं, और फिर 3. यंत्रवत् कीमा बनाया हुआ। स्केल सलाखों 1 सेमी प्रतिनिधित्व करते हैं। 4. कीमा बनाया हुआ ईसीएम तो cryomilled जा सकता है, जो फोम निर्माण के लिए वैकल्पिक है, लेकिन microcarrier संश्लेषण के लिए आवश्यक। स्केल बार 3 मिमी प्रतिनिधित्व करता है। 5. कीमा बनाया हुआ या cryomilled ईसीएम तो α-amylase साथ पचा और एक समरूप ईसीएम निलंबन बनाने के लिए homogenized है। स्केल बार 1 सेमी प्रतिनिधित्व करता है। <strओंग> 6a) फोम निर्माण के लिए, ईसीएम निलंबन उपयोगकर्ता परिभाषित ढालना, जमे हुए, और lyophilized में एक अच्छी तरह से परिभाषित ज्यामिति के साथ एक खुली 3 डी पाड़ उत्पन्न करने के लिए स्थानांतरित कर रहा है। स्केल बार 1 सेमी प्रतिनिधित्व करता है। 6b) microcarrier निर्माण के लिए, cryomilled ईसीएम निलंबन असतत गोलाकार microcarriers उत्पन्न करने के लिए electrosprayed है। स्केल बार 2 मिमी प्रतिनिधित्व करता है। 7. फोम और microcarriers फिर धीरे-धीरे rehydrated और कोशिकाओं के साथ वरीयता प्राप्त किया जा सकता है। प्रतिनिधि छवियों (व्यवहार्य कोशिकाओं = हरा) मानव ASCs के लिए दिखाए जाते हैं एक डैट फोम (बाएं) और डैट microcarrier (दाएं) पर वरीयता प्राप्त। स्केल सलाखों 100 सुक्ष्ममापी प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
सामान्य तौर पर, decellularized ऊतकों से प्राप्त bioscaffolds और अधिक बारीकी से जटिल 3 डी संरचना और देशी सेलुलर सूक्ष्म पर्यावरण में ईसीएम की संरचना का अनुमान लगा सकता सिंथेटिक scaffolds या मानक संस्कृति मॉडल 2 डी TCPS के आधार पर की तुलना में। पहले चर्चा के रूप में, सेल ईसीएम बातचीत दोनों संस्कृति में और शरीर 1 में सेलुलर व्यवहार में मध्यस्थता करने में गंभीर रूप से महत्वपूर्ण हैं। यह मानते हुए कि ईसीएम के, जैव रासायनिक जैवभौतिक, और जैवयांत्रिकी गुण प्रत्येक ऊतक के लिए अद्वितीय हैं, वहाँ के रूप में भी अधिक के विकास में, ऊतक इंजीनियरिंग के लिए biomaterials के डिजाइन में ऊतक विशेष दृष्टिकोण को लागू करने के लिए तर्क के समर्थन के प्रमाण बढ़ती जा रही है इन विट्रो प्रयोगों 20 के लिए physiologically प्रासंगिक संस्कृति मॉडल। एक शुरू करने सामग्री के रूप में decellularized ऊतकों का उपयोग, हमारे तरीकों को और अधिक ग्राहक भीतर ऊतक विशेष ईसीएम की जटिल संरचना शामिल कर सकते हैंomizable पाड़ प्रारूपों। यांत्रिक और एंजाइमी संसाधन चरणों देशी ईसीएम फैटी का नुकसान में परिणाम होगा, वहीं डैट के साथ पिछले अध्ययनों ने दिखाया है कि वसा व्युत्पन्न ईसीएम के शिक्षाप्रद प्रभाव इन पाड़ स्वरूपों में संरक्षित कर रहे हैं, सुझाव है कि bioscaffold रचना एक महत्वपूर्ण मध्यस्थ है सेल समारोह 11, 29 की। सेल संस्कृति substrates के रूप में ईसीएम व्युत्पन्न फोम और microcarriers का उपयोग कर बरकरार decellularized ऊतकों की तुलना में करने के लिए एक महत्वपूर्ण लाभ यह है कि वे अधिक सजातीय हैं, जो कोशिका वितरण और सेल सेल / सेल ईसीएम बातचीत में एकरूपता में सुधार कर सकते है।
यहाँ वर्णित तरीकों सेल संस्कृति और ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों में प्रयोग के लिए ऊतक विशेष bioscaffolds की एक व्यापक श्रेणी उत्पन्न करने के लिए उपयोग किया जा सकता। उदाहरण के लिए, डैट, डीडीटी, और dlv के अलावा, हमारे प्रयोगशाला सफलतापूर्वक इन तकनीकों 3 डी पोर उत्पन्न करने के लिए आवेदन किया हैous फोम decellularized हड्डी, उपास्थि, नाभिक pulposus, और वलय फाइब्रोसिस, साथ ही वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध, अघुलनशील कोलेजन गोजातीय कण्डरा से प्राप्त का उपयोग कर। एक इन विट्रो दृष्टिकोण से, इन bioscaffolds एक आधार के रूप में उच्च निष्ठा 3 डी संस्कृति मॉडल के लिए कोशिका जीव विज्ञान, शरीर विज्ञान या रोग विकृति 38 की जांच के लिए, उच्च throughput दवा स्क्रीनिंग प्लेटफार्मों 39, या स्टेम के लिए के रूप में शिक्षाप्रद मैट्रिक्स में जैवसक्रिय substrates के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता सेल भेदभाव 40, 41। डैट, डीडीटी और dlv फोम 25 की सांद्रता में गढ़े – 50 मिलीग्राम / एमएल इन विट्रो संस्कृति (28 दिनों के लिए परीक्षण किया) में लंबी अवधि में स्थिर रहे हैं। कम से कम 2 सप्ताह के लिए – (15 आरपीएम 10) इसके अलावा, microcarriers के सभी तीन प्रकार के एक कम कतरनी स्पिनर संस्कृति प्रणाली में सेल लगाव और गतिशील परिस्थितियों में प्रसार का समर्थन कर सकते हैं। इन विवो अनुप्रयोगों के लिए, biocompatible और biodegradable ईसीएम व्युत्पन्न फोम और microcarriers रचनात्मक ऊतक remodeling और उत्थान 11, 29 प्रोत्साहित करने के लिए ऑफ-द-शेल्फ उत्पादों के रूप में वादा पकड़। इसके अलावा, सेल चिपकने वाला scaffolds सेल थेरेपी वितरण प्रणाली 42, 43 के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता। उदाहरण के लिए, डैट फोम जब अनुवांशिक रूप से भिन्न ASCs के साथ वरीयता प्राप्त और एक असुरक्षित चूहे मॉडल 29 में subcutaneously प्रत्यारोपित एंजियोजिनेसिस और वसाजनन बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया है। बरकरार डैट के सापेक्ष, अधिक उच्च संसाधित डैट और अधिक तेजी से अपमानित फोम मात्रा में 50% की कमी के साथ, 3 सप्ताह में उल्लेख के रूप में वे 12 सप्ताह से मेजबान ऊतकों के साथ एकीकृत हो गया है, और लगभग पूरा हो गया अवशोषण। हालांकि, फोम भी एक अधिक शक्तिशाली वाहिकाजनक प्रतिक्रिया प्रेरित हुए यह कहा कि एंजाइम पचा ईसीएम अद्वितीय समर्थक पुनर्योजी प्रभाव पड़ा। इसी प्रकार, ईसीएम व्युत्पन्न microcarriers इन विट्रो के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता </ em> गतिशील संस्कृति प्रणालियों के भीतर सेल संस्कृति substrates और के रूप में इंजेक्शन सेल वितरण वाहनों 11, 30, 44। विशेष रूप से, microcarriers के छोटे व्यास और बड़े सतह क्षेत्र है, जबकि एक मैट्रिक्स सेल व्यवहार्यता का समर्थन और इंजेक्शन 30 के स्थल पर सेल प्रतिधारण बढ़ाने के लिए मदद कर सकते हैं प्रदान करने, एक छोटी मात्रा में कोशिकाओं की एक बड़ी मात्रा का वितरण सक्षम हो सकता है। किसी भी जीवित प्रणाली में उपयोग करने से पहले, यह सुनिश्चित करना है कि स्रोत ईसीएम प्रतिजनी सेलुलर घटकों और / या संभावित साइटोटोक्सिक decellularization अभिकर्मकों कि एक नकारात्मक मेजबान प्रतिक्रिया 7 को चालू कर सकते का काफी हद तक रहित है महत्वपूर्ण है।
प्रोटियोलिटिक एंजाइम पेप्सिन सामान्यतः ईसीएम व्युत्पन्न हाइड्रोजेल 15 की तैयारी में इस्तेमाल किया जाता है। पेप्सिन एक गैर विशिष्ट प्रोटीज कि कोलेजन और अन्य ईसीएम प्रोटीन int पचाने जाएगाओ छोटे टुकड़ों 45। जबकि पेप्सिन-पचा ईसीएम से निर्मित हाइड्रोजेल सेल शिक्षाप्रद प्रभाव सूचित किया गया है, एक सीमा यह है कि इन सामग्रियों अत्यंत यंत्रवत् कमजोर 46 हो जाते हैं है। डैट microcarriers के बारे में हमारी प्रारंभिक विकास में, हम एक समग्र दृष्टिकोण है, जिसमें पेप्सिन-पचा डैट alginate के साथ संयुक्त किया गया था और गोलाकार मोती 30 के रूप में 2 CaCl में dropwise जोड़ा का उपयोग किया। मोती बाद में तस्वीर-तिर्यक थे और alginate सोडियम साइट्रेट का उपयोग कर निकाला गया था। 950 सुक्ष्ममापी 30 – रासायनिक तिर्यक के लिए आवश्यकता के अलावा, एक महत्वपूर्ण सीमा यह है कि microcarriers इस दृष्टिकोण के साथ गढ़े 900 का एक आकार सीमा से नीचे गरीब स्थिरता था। पेप्सिन के स्थान में, यहाँ प्रस्तुत तरीकों α-amylase ग्लाइकोलाइटिक एंजाइम है, जो telope से कार्बोहाइड्रेट समूहों तोड़ना को माना गया है के साथ ईसीएम का एक और अधिक हल्के पाचन का उपयोगकोलेजन के ptide क्षेत्रों, जिससे एसिटिक एसिड 37 में घुलनशीलता बढ़ रही है। यह दृष्टिकोण अत्यधिक polymerized कोलेजन कि रासायनिक तिर्यक या अन्य additives की आवश्यकता के बिना शुद्ध ईसीएम व्युत्पन्न फोम और microcarriers उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता के अलगाव सक्षम बनाता है। ये bioscaffolds अच्छी तरह से संरक्षित कोलेजन तंतुओं, देशी ईसीएम सूक्ष्म पर्यावरण में कोलेजन के समान के बीच शारीरिक संपर्क और हाइड्रोजन संबंध के माध्यम से स्थिर हो जाता है।
फोम कि चयनित विशिष्ट मोल्ड के आधार पर ज्यामिति की एक विस्तृत श्रृंखला में निर्मित किया जा सकता है एक बेहद लचीला मंच है। सेल संस्कृति अध्ययन के लिए, फोम कोटिंग्स या मोटाई अलग से 3 डी scaffolds के रूप में अच्छी तरह से TCPS प्लेटों में सीधे डाली जा सकती है। बहुत वर्दी सतहों के साथ 3 डी फोम निर्माण करने के लिए, यह अनुशंसित है कि एक कस्टम मोल्ड डिज़ाइन किया गया है कि प्लास्टिक या कांच स्लाइड के साथ दोनों पक्षों पर बंद किया जा सकता। या तो कीमा या cryomilled ईसीएम के संश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकताफोम। सामान्य तौर पर, हमने पाया है कि cryomilled फोम macroscopically नरम हो सकता है और 36 कम सांद्रता 31 पर एक और अधिक बाधित फैटी हो जाते हैं। ऊतक स्रोत के आधार पर, अतिरिक्त यांत्रिक प्रसंस्करण चरणों ईसीएम रचना है कि सेल समारोह पर प्रभाव पड़ सकता में परिवर्तन हो सकता है। उदाहरण के लिए, हमारे पिछले काम में, laminin कीमा बनाया हुआ dlv फोम में पता चला था, लेकिन cryomilled नहीं dlv foams 31। इसके विपरीत, कोलेजन मैं, कोलेजन चतुर्थ, laminin, और फाइब्रोनेक्टिन दोनों कीमा बनाया हुआ में पता चला और cryomilled डैट foams 36 थे। यांत्रिक प्रसंस्करण चरणों के अलावा, फोम की सरंध्रता और छेद के आकार ईसीएम निलंबन एकाग्रता और ठंड तापमान 47 अलग से कुछ हद तक नियोजित किया जा सकता। सामान्य तौर पर, कम एकाग्रता फोम (~ 10 – 15 मिलीग्राम / एमएल) गुणात्मक अधिक झरझरा हैं, लेकिन तेजी से अनुबंध कर सकते हैं और गरीब हैलंबे समय तक संस्कृति 31, 36 में स्थिरता। इसी तरह, एक धीमी ठंड दर, आम तौर पर एक उच्च ठंड तापमान के द्वारा प्राप्त किया, निर्माण 29 के दौरान गठन बर्फ के क्रिस्टल के आकार के कारण फोम में बड़े pores हो सकती है। इन मानकों के सभी सहित लगाव, घुसपैठ, और पुर्ननिर्माण सामग्री, के साथ सेल बातचीत को प्रभावित कर सकते। उदाहरण के लिए, कि उच्च सांद्रता के साथ ईसीएम गढ़े रहे फोम पर कोशिकाओं की वृद्धि, सतह क्षेत्रों तक सीमित किया जा सकता है विशेष रूप से कीमा बनाया हुआ ईसीएम स्रोतों के साथ और स्थिर संस्कृति की स्थिति 36 के तहत।
microcarriers के लिए, कुंजी पैरामीटर नियोजित किया जा सकता ईसीएम निलंबन एकाग्रता, सुई गेज, और लागू वोल्टेज, उच्च सांद्रता आम तौर पर microcarriers कि लंबी अवधि के गतिशील संस्कृति के तहत और अधिक स्थिर रहे हैं उपज के साथ कर रहे हैं। electrospraying की दीक्षा के बाद, ईसीएम सस्पेंसआयन बूंदों जल्दी से, कुप्पी के केंद्र में गिर चाहिए एल्यूमीनियम पन्नी कलेक्टर की दिशा की ओर। एकत्रीकरण रोकने के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि मोती पन्नी से पहले तरल नाइट्रोजन से संपर्क करें। सुई और तरल नाइट्रोजन की सतह के बीच की दूरी इन आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए समायोजित किया जा सकता। यह नोट करना एकाग्रता रेंज है कि स्थिर bioscaffolds उत्पन्न होगा के चयन में है कि अनुकूलन प्रत्येक विशिष्ट ईसीएम स्रोत के गुणों के आधार पर आवश्यक हो सकता है, विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। एक अन्य महत्वपूर्ण कारक है कि decellularization तरीकों कि ईसीएम या अवशिष्ट अभिकर्मकों (जैसे, सर्फेकेंट्स) की उपस्थिति नकारात्मक परिणामी फोम और microcarriers की स्थिरता को प्रभावित कर सकते नीचा के रूप में शुरू सामग्री उत्पन्न करने के लिए प्रयोग किया जाता है decellularization प्रोटोकॉल है। चुनौतियों bioscaffold स्थिरता, विकल्प है कि एक अधिक क्रमिक पुनर्जलीकरण प्रक्रिया का उपयोग शामिल है जांच की जा सकती है, ईसीएम susp में वृद्धि के साथ सामना करना पड़ा रहे हैंension एकाग्रता, और cryomilled ईसीएम बनाम कीमा बनाया हुआ की खोज। इन विकल्पों में से सभी समस्या को हल करने के लिए असफल हो, यह विकल्प decellularization प्रोटोकॉल या ईसीएम स्रोतों का पता लगाने के लिए आवश्यक हो सकता है।
पाड़ उत्पादन के दौरान reproducibility सुनिश्चित करने के लिए, विशेष देखभाल प्रोटोकॉल में कुछ चरणों में लिया जाना चाहिए। जब decellularized ऊतकों cryomilling, यह अनुशंसित है कि मिलिंग वातावरण से नमी की अवशोषण की वजह से तुरंत एक सूखी कण एकत्रीकरण की संभावना को कम करने के लिए वातावरण में lyophilization के बाद आयोजित किया। microcarrier निर्माण के दौरान, यह सुझाव दिया है कि निलंबन 3 एमएल की एक अधिकतम मात्रा के साथ, छोटे बैचों में electrosprayed है, नमूना ठंडा के साथ मुद्दों है कि सुई के जाम में परिणाम कर सकते से बचने के लिए। इसके अलावा, यह जरूरी है कि microcarriers electrospraying प्रक्रिया के बाद पिघलना अनुमति नहीं है। उनके गोलाकार ज्यामिति और यांत्रिक स्थिरता, microcarri बनाए रखने के लिएईआरएस तरल नाइट्रोजन से एकत्र किया जाना चाहिए, एक तरल नाइट्रोजन से भरे कंटेनर में ले जाया, और तुरंत lyophilized। अंत में, दोनों फोम और microcarriers के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि पुनर्जलीकरण चरणों से अधिक दिनों की अवधि में धीरे-धीरे प्रदर्शन कर रहे हैं। रैपिड पुनर्जलीकरण स्थूल और / या सूक्ष्म पैमाने पर संरचनात्मक पतन हो सकता है। इसके अलावा, पुनर्जलीकरण धीरे पाड़ के भीतर छोटे हवाई बुलबुले, जो प्रकाश निर्वात के तहत देगास के लिए समय की एक महत्वपूर्ण राशि की आवश्यकता होती है सकते हैं के गठन को रोकने के लिए होने चाहिए।
अंत में, इस पत्र में प्रस्तुत तरीकों ऊतक विशेष फोम और microcarriers शुद्ध, गैर रासायनिक तिर्यक ईसीएम के शामिल की एक विविध सरणी निर्माण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। जैविक शोधकर्ताओं के लिए एक लाभ यह है कि bioscaffolds संभाल करने के लिए आसान कर रहे हैं और जब इस तरह के ऊतक विज्ञान, इम्युनोहिस्टोकैमिस्ट्री, या जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति assays के रूप में तकनीक के साथ विश्लेषण प्रदर्शन कर ऊतकों को इसी तरह से संसाधित किया जा सकता है।इसके अलावा, ईसीएम व्युत्पन्न scaffolds enzymatically वरीयता प्राप्त सेल आबादी को निकालने के लिए अवक्रमित हो सकता है या बायोडिग्रेडेबल और biocompatible सेल वितरण वाहनों के रूप में सीधे इस्तेमाल किया जा सकता है। कुल मिलाकर, यह लचीला मंच प्रौद्योगिकी 3 डी सेल संस्कृति सेल समारोह की जांच के अध्ययन के लिए सहित कई अनुप्रयोगों के लिए बड़ी उपयोगिता, सेल विस्तार substrates के रूप में रखती है, और के रूप में समर्थक पुनर्योजी bioscaffolds।
The authors have nothing to disclose.
The Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) of Canada and the Canadian Institutes of Health Research (CIHR) have provided funding for this work. The authors would like to acknowledge Dr. Amin Rizkalla for the use of his electrospraying system, the Nanofabrication Facility at Western University for use of SEM imaging equipment, the Mount Brydges Abattoir for the provision of porcine tissue samples, and Drs. Aaron Grant, Brian Evans, and Robert Richards for their clinical collaborations in support of this research.
Acetic acid, glacial | BioShop | ACE222.500 | |
Alligator clip leads | VWR | 470149-728 | |
Aluminium foil | Fisher Scientific | 01-213-101 | |
a-amylase | Sigma | 101074694 | from Aspergillus aryzae |
Analytical balance | Sartorius | CPA225D | |
Centrifuge | Thermo Scientific | 75004251 | With swinging bucket rotor for 15 and 50 mL centrifuge tubes |
Centrifuge tubes (15 mL) | Sarstedt | 62.554.205 | |
Centrifuge tubes (50 mL) | Sarstedt | 62.547.205 | |
Collagen from bovine achilles tendon (insoluble) | Sigma | C9879 | Or similar insoluble collagen source; Can be used as an alternative to decellularized tissues to fabricate the foams and microcarriers |
Cryomilling system | Retsch | 20.745.0001 | MM 400 |
Dessicator | Fisher Scientific | 8624426 | For lyophilized ECM and bioscaffold storage |
DMEM: F12 Hams | Sigma | D6421 | Used for proliferation media |
Dewar flask | Fisher Scientific | 10-196-6 | Low form; volume range of 250 – 500 mL |
Double distilled water | From Barnstead GenPure xCAD Water Purification System | ||
D-PBS | Wisent | 311425125 | |
ECM | Isolated from human adipose tissue, porcine dermis or porcine myocardium, as described in Flynn et al. 2010, Reing et al. 2010, and Wainwright et al. 2010 (ref # 28, 8, 32) | ||
Ethanol | Greenfield Specialty Alcohols Inc. | P016EAAN | Absolute |
Fetal bovine serum | Wisent | 80150 | Used for proliferation media |
Forceps | VWR | 37-501-32 | For transferring the foams |
Freezer (-20 °C) | VWR | 97043-346 | |
Freezer ( -80 °C) | Thermo Scientific | EXF40086A | |
Glass vials | Fisher Scientific | 03-339-26D | To store lyophilized cryomilled ECM |
Hand held homogenizer | Fisher Scientific | 14-359-251 | Speed: 8000 – 30,000 RPM |
Homogenizer accessories: saw tooth bottom generator probes | Fisher Scientific | 14-261-17 | 10 X 95 mm |
Liquid nitrogen | For electrospraying | ||
Lyophilizer | Labconco | 7750021 | FreeZone4.5 |
Milling chamber | Retsch | 02.462.0213 | 25 mL volume recommended |
Milling balls | VWR | 16003-606 | 10 mm diameter, stainless steel recommended |
18G needle | VWR | C ABD305185 | For dispensing ECM suspension into moulds |
Orbital incubator shaker | SciLogex | 832010089999 | Temperature controlled (37 °C) |
Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | Used for proliferation media |
Pipet-Aid XP | Mandel Scientific | DRU-4-000-101 | |
Retort stand | VWR | 470019-526 | |
Retort stand clamp | VWR | 21573-606 | |
Safety-Lok Syringe | BD | 309606 | 3 mL luer lock syringe for microcarrier fabrication and dispensing ECM suspension |
Serological pipettes (10 mL ) | Sarstedt | 86.1254.001 | |
Serological pipettes (25 mL) | Sarstedt | 86.1685.001 | |
Sodium chloride | BioShop | 7647-14-5 | |
Sodium phosphate monobasic | BioShop | 10049-21-5 | |
Scoopula | VWR | 89259-968 | For collecting microcarriers |
Surgical scissors | VWR | 82027-590 | |
Syringe pump | VWR | 10117-490 | Microprocessor controlled |
High voltage power supply | Gamma High Voltage Research | ES30P-5W/DDPM | Capable of recommended 15 – 25 kV voltage range |
12-well plates | Fisher Scientific | 12565321 | For use as molds during foam fabrication; Other sizes or user-defined molds can also be selected |
Winged infusion set | Terumo | 22258092 | 30 cm tubing length, 25 G 3/4 " recommended; Other needle gauges can be used and may influence microcarrier diameter |