ניתוח של הפסקת תמלול שימוש BrUTP גדיל ספציפי התמלול Run-על (TRO) גישה
Summary
We describe a basic experimental approach for analysis of termination of transcription by RNA polymerase II in vivo using BrUTP by the strand-specific transcription run-on (TRO) approach in budding yeast. This protocol can be extended to study transcription termination by other RNA polymerases both in yeast and higher eukaryotes.
Abstract
כתב יד זה מתאר פרוטוקול לאיתור פגם סיום שעתוק in vivo. פרוטוקול TRO ספציפי הגדיל באמצעות BrUTP המתואר כאן הוא גישה ניסויית עצמה לניתוח פגם סיום שעתוק בתנאים פיסיולוגיים. כמו assay TRO המסורתי, היא מסתמכת על הנוכחות של פולימראז תעתיק פעיל מעבר סוף '3 של גן כאינדיקטור פגם סיום שעתוק 1. זה מתגבר שתי בעיות עיקריות נתקלו עם assay TRO המסורתי. ראשית, הוא יכול לזהות אם פולימראז שקרא את אות הסיום הוא זה שיזם שעתוק מאזור האמרגן-הפרוקסימלי, או אם זה פשוט מייצג פולימראז transcribing pervasively שיזם הלא במיוחד מאיפשהו בגוף או '3 סוף הגן. שנית, הוא יכול להבחין אם אות פולימראז הפעילה תעתיק מעברבאזור terminator הוא באמת mRNA תחושה readthrough transcribing פולימראז או אות רנ"א אנטי במובן הלא קידוד terminator ביוזמת. בקצרה, פרוטוקול כרוך permeabilizing התאים שמרים גדל באופן אקספוננציאלי, מה שמאפשר את תמלילי כי יזם in vivo כדי להאריך בנוכחות של נוקלאוטיד BrUTP, טיהור RNA שכותרתו BrUTP לפי הגישה זיקה, הפוכה טרח להכין את RNA המתהווה מטוהרים הגברה cDNA באמצעות פריימרים גדיל ספציפי איגוף האמרגן ואת אזורי terminator של הגן 2.
Introduction
מחזור שעתוק איקריוטיים מורכב משלושה שלבים עיקריים; ייזום, התארכות והפסקה. סיומו של שעתוק על ידי RNA פולימראז II מורכב משני שלבים ברורים, תלויים זה בזה 3. השלב הראשון כולל מחשוף, polyadenylation ושחרור mRNA מהתבנית, והוא ומיד אחריו את השלב השני, בסימן ההתנתקות של פולימראז מהתבנית. סיום נכון הוא קריטי עבור המחזור של פולימראז במהלך חניכה / reinitiation של שעתוק, למניעת הפרעה עם השעתוק של גנים במורד זרם, ולשמירתו שעתוק סוטה לבדוק על ידי הגבלת השעתוק של מתפשט ללא קידוד RNA 4, 5. למרות ההתקדמות שחלה באחרונה, סיום הוא ללא ספק צעד הבין לפחות של מחזור שעתוק RNA פולימראז II. Assay סיום אמין חיוני ללימוד מנגנון underlyinסיום שעתוק g ידי RNA פולימראז II in vivo.
מספר גישות ניסיוניות המשמשים לאיתור פגם הסיום ב גן transcribing פעיל בתנאים פיסיולוגיים. אלה כוללים כתם הצפון, שבב גורם סיום (הכרומטין immunoprecipitation) ואת assay TRO המסורתית. כל הטכניקות האלה יש כמה יתרונות וחסרונות. את assay TRO המסורתי היה אמור להיות הגישה האמינה והרגישה ביותר לגילוי פגם סיום שעתוק vivo 1. assay זה localizes מולקולות פולימראז הפעילות יעתיק על אזורים שונים של גן בתוך התא. בתנאים רגילים, assay תערוכות מולקולות פולימראז מעורב תעתיק מופץ אך ורק בין אזור האמרגן terminator של (איור 1 א) הגן. עם הסיום פגום, לעומת זאת, פולימראז הוא לא יודע לקרוא את אות הסיוםוהוא זוהה באזור במורד הזרם של 3 'בסוף של הגן (איור 1B).
פגם סיום שעתוק מתבטא בנוכחות פולימראז חוש-בהעתקה שיזמה מאזור האמרגן-הפרוקסימלי, ולהיות מסוגל לקרוא את אות הסיום, ממשיך transcribing באזור במורד הזרם של סוף '3 של גן כפי שמוצג באיור 2A. עם ההכרה כי הגנום האיקריוטים מפגין שעתוק מתפשט המכריע במובן וכן כיוונים אנטי תחושה בתוך ומסביב גן 6, 7, 8, 9, 10, עד מהרה התברר כי assay TRO המסורתי אינו יכול לזהות אם האות פולימראז במורד הזרם של גן מייצג תעתיק ביוזמת האמרגן (איור 2 א) או RNA סוטה שיזמה סוםewhere באמצע הגן או במורד הזרם של אלמנט terminator (איור 2 ב), או בהעתקת פולימראז בכיוון אנטי תחושה מסוף '3 של הגן (איור 2 ג). את assay TRO ספציפי גדיל באמצעות BrUTP המתואר כאן ניתן להבחין אם האות פולימראז readthrough ציין מייצג mRNA במשמעות הרחבה ביוזמת האמרגן או תמליל אנטי במובן זה יזם במורד הזרם של הגן תחת בחינה. השתמשנו בהצלחה את הגישה הזאת כדי להדגים את התפקיד של קינאז Kin28 לסיום שעתוק ניצני שמרים 2. תוך שימוש בגישה כאן אנו מראים כי Rna14 נדרשת להפסקת השעתוק של ASC1 ב ניצני שמרים.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול TRO ספציפי הגדיל משמש כאן הותאם מן הפרוטוקול המשמש GRO-Seq (Global לרוץ על-רצף) ניתוח בתאי יונקים 12. אנחנו בהצלחה שונה בפרוטוקול ללמוד שעתוק המתהווה ב ניצני שמרים. כדי לנתח את פגם סיום שעתוק במיוחד, מתאמנים את הפרוטוקול נוסף על ידי להיפטר צעד הידרוליזה RNA…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research in Ansari lab was supported by the research grant (No. MCB 1020911) from National Science Foundation.
Materials
| Phenol -chloroform-isoamyl alcohol mixture | Sigma-Aldrich | 77619 | pH 4-5 |
| TRIzol reagent | Life technologies | 15596-026 | |
| RNase Inhibitor, human placenta | New England Biolabs | M0307S | |
| Anti-BrdU beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-32323AC | |
| Protoscript II | New England Biolabs | M03368L | or an equivalent enzyme |
| Advantage 2 polymerase Mix | Clontech | 639201 | or an equivalent enzyme |
| 5-Bromouridine 5' triphosphate sodium salt | Santa Cruz Biotechnology | sc-214314A | |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| ATP | New England Biolabs | N0451AA | |
| CTP | N0454AA | ||
| GTP | N0452AA | ||
| Ultra-pure bovine serum albumin (BSA) | MC Labs | UBSA-100 | |
| Asc1 B | AGATTCGTCGGTCACAAGTCC | ||
| Asc1 C | GAACTTTATACATATTCTTAGTT AGCAGTC |
||
| Asc1 D | TGTACATATGTATTTTCGCAGCA | ||
| Asc1 E | GCCAAGGAGACTGAATTTAATG | ||
| Asc1 F | CTATGGAATGGGGGTTTTAAG | ||
| Asc1 G | GGTTATGGCAGACATGCCAC | ||
| 5s cDNA | AGATTGCAGCACCTGAGT | ||
| 5’ 5s reverse | GGTTGCGGCCATATCTAC | ||
| 3’ 5s reverse | TGAGTTTCGCGTATGGTC |
Referências
- Birse, C. E., Minvielle-Sebastia, L., Lee, B. A., Keller, W., Proudfoot, N. J. Coupling termination of transcription to messenger RNA maturation in yeast. Science. 280 (5361), 298-301 (1998).
- Medler, S., Ansari, A. Gene looping facilitates TFIIH kinase-mediated termination of transcription. Sci Rep. 5, 12586 (2015).
- Richard, P., Manley, J. L. Transcription termination by nuclear RNA polymerases. Genes Dev. 23 (11), 1247-1269 (2009).
- Mischo, H. E., Proudfoot, N. J. Disengaging polymerase: terminating RNA polymerase II transcription in budding yeast. Biochim Biophys Acta. 1829 (1), 174-185 (2013).
- Porrua, O., Libri, D. Transcription termination and the control of the transcriptome: why, where and how to stop. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (3), 190-202 (2015).
- Jacquier, A. The complex eukaryotic transcriptome: unexpected pervasive transcription and novel small RNAs. Nat Rev Genet. 10 (12), 833-844 (2009).
- Xu, Z., et al. Bidirectional promoters generate pervasive transcription in yeast. Nature. 457 (7232), 1033-1037 (2009).
- Neil, H., et al. Widespread bidirectional promoters are the major source of cryptic transcripts in yeast. Nature. 457 (7232), 1038-1042 (2009).
- Clark, M. B., et al. The reality of pervasive transcription. PLoS Biol. 9 (7), e1000625 (2011).
- Goodman, A. J., Daugharthy, E. R., Kim, J. Pervasive antisense transcription is evolutionarily conserved in budding yeast. Mol Biol Evol. 30 (2), 409-421 (2013).
- El Kaderi, B., Medler, S., Ansari, A. Analysis of interactions between genomic loci through Chromosome Conformation Capture (3C). Curr Protoc Cell Biol. Chapter 22, Unit22 15 (2012).
- Core, L. J., Waterfall, J. J., Lis, J. T. Nascent RNA sequencing reveals widespread pausing and divergent initiation at human promoters. Science. 322 (5909), 1845-1848 (2008).
