Perfilado Redox Celular Utilizando Microscopía de Alto Contenido
Summary
Este trabajo presenta un flujo de trabajo de microscopía de alto contenido para la cuantificación simultánea de los niveles de ROS intracelular, así como el potencial de membrana mitocondrial y la morfología -conocidas conjuntamente como morfofonción mitocondrial- en células adherentes vivas utilizando las moléculas reportero fluorescentes permeantes a las células 5- 6) – clorometil – 2 ', 7' – diclorodihidrofluoresceína, éster acetilico (CM – H _ { 2 } DCFDA) y éster metílico de tetrametilrodamina (TMRM).
Abstract
Las especies de oxígeno reactivo (ROS) regulan los procesos celulares esenciales incluyendo la expresión génica, la migración, la diferenciación y la proliferación. Sin embargo, los niveles excesivos de ROS inducen un estado de estrés oxidativo, que se acompaña de daño oxidativo irreversible al ADN, lípidos y proteínas. Por lo tanto, la cuantificación de ROS proporciona un proxy directo para la condición de salud celular. Dado que las mitocondrias están entre las principales fuentes celulares y objetivos de ROS, el análisis conjunto de la función mitocondrial y la producción de ROS en las mismas células es crucial para comprender mejor la interconexión en condiciones fisiopatológicas. Por lo tanto, se desarrolló una estrategia basada en la microscopía de alto contenido para la cuantificación simultánea de los niveles intracelulares de ROS, el potencial de membrana mitocondrial (ΔΨ m ) y la morfología mitocondrial. Se basa en microscopía de fluorescencia de campo ancho automatizada y análisis de imágenes de células adherentes vivas, crecidas en placas de pocillos múltiples, y staineD con las moléculas fluorescentes CM-H 2 DCFDA (ROS) y TMRM (ΔΨm y morfología mitocondrial) permeables a las células. En contraste con la fluorimetría o la citometría de flujo, esta estrategia permite cuantificar los parámetros subcelulares a nivel de la célula individual con alta resolución espacio-temporal, tanto antes como después de la estimulación experimental. Es importante destacar que la naturaleza basada en imágenes del método permite extraer parámetros morfológicos además de intensidades de señal. El conjunto combinado de características se utiliza para el análisis exploratorio y estadístico de datos multivariados para detectar diferencias entre subpoblaciones, tipos de células y / o tratamientos. Aquí, se proporciona una descripción detallada del ensayo, junto con un ejemplo de experimento que demuestra su potencial para la discriminación inequívoca entre los estados celulares después de la perturbación química.
Introduction
La concentración de ROS intracelular se regula meticulosamente a través de una interacción dinámica entre la producción de ROS y ROS sistemas de desactivación. El desequilibrio entre los dos provoca un estado de estrés oxidativo. Entre las principales fuentes de ROS están las mitocondrias 1 . Dado su papel en la respiración celular, son responsables de la mayor parte de las moléculas de superóxido intracelular (O 2 • – ) 2 . Esto se debe principalmente a la fuga de electrones a O 2 en el complejo 1 de la cadena de transporte de electrones bajo condiciones de fuerte potencial negativo interno de membrana mitocondrial (Δψ m ), es decir , hiperpolarización mitocondrial. Por otra parte, la despolarización mitocondrial también se ha correlacionado con una mayor producción de ROS apuntando a múltiples modos de acción 3 , 4 , 5 ,> 6 , 7 , 8 . Además, a través de modificaciones redox en las proteínas de la fisión-fusión maquinaria, ROS co-regular la morfología mitocondrial 9. Por ejemplo, la fragmentación se correlaciona con el aumento de la producción de ROS y apoptosis [ 10 , 11] , mientras que las mitocondrias filamentosas se han vinculado a la inanición de nutrientes y protección contra Mitófago 12 . Dada la intrincada relación entre el ROS celular y la morfofunción mitocondrial, ambos deberían idealmente ser cuantificados simultáneamente en células vivas. Para ello, se desarrolló un ensayo de imagen de alto contenido basado en microscopía automatizada de campo ancho y análisis de imágenes de cultivos celulares adherentes teñidos con las sondas fluorescentes CM-H 2 DCFDA (ROS) y TMRM (mitocondrial Δψ m y morfología). Imágenes de alto contenido se refiere a la extracción de spAtiotemporally rico ( es decir , un gran número de características descriptivas) información sobre fenotipos celulares utilizando múltiples marcadores complementarios y análisis de imagen automatizada. Cuando se combinan con microscopía automatizada, muchas muestras pueden ser examinadas en paralelo ( es decir, de alto rendimiento), aumentando así el poder estadístico del ensayo. De hecho, un activo principal del protocolo es que permite la cuantificación simultánea de múltiples parámetros en la misma célula, y esto para un gran número de células y condiciones.
El protocolo se divide en 8 partes (descritas en detalle en el siguiente protocolo): 1) siembra de células en una placa de 96 pocillos; 2) Preparación de soluciones madre, soluciones de trabajo y tampón de formación de imágenes; 3) Montaje del microscopio; 4) Carga de las células con DCFDA CM-H 2 y TMRM; 5) Primer ciclo de imágenes en vivo para medir los niveles basales de ROS y la morfofunción mitocondrial; 6) Segunda ronda de imágenes en vivo después de la adición de terc -butilPeróxido (TBHP) para medir los niveles de ROS inducidos; 7) Análisis automatizado de imágenes; 8) Análisis de Datos, Control de Calidad y Visualización.
El ensayo se desarrolló originalmente para fibroblastos dérmicos humanos normales (NHDF). Dado que estas células son grandes y planos, que son muy adecuados para la evaluación de la morfología mitocondrial en 2D imágenes widefield [ 13 , 14] . Sin embargo, con modificaciones menores, este método es aplicable a otros tipos de células adherentes. Por otra parte, junto a la combinación de CM-H 2 DCFDA y TMRM, el flujo de trabajo cumple con una variedad de pares de tintes fluorescentes con diferentes especificidades moleculares [ 1 , 15] .
Protocol
Representative Results
Discussion
Este artículo describe un método de microscopía de alto contenido para la cuantificación simultánea de los niveles intracelulares de ROS y morfofonción mitocondrial en NHDF. Su desempeño se demostró con un estudio de caso sobre NHDF tratado con SQV. Los resultados apoyan la evidencia anterior de la literatura en la que se han observado niveles elevados de ROS o disfunción mitocondrial después del tratamiento con inhibidores de la proteasa del VIH de tipo 1, aunque en experimentos separados 19…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by the University of Antwerp (TTBOF/29267, TTBOF/30112), the Special Research Fund of Ghent University (project BOF/11267/09), NB-Photonics (Project code 01-MR0110) and the CSBR (Centers for Systems Biology Research) initiative from the Netherlands Organization for Scientific Research (NWO; No: CSBR09/013V). Parts of this manuscript have been adapted from another publication1, with permission of Springer. The authors thank Geert Meesen for his help with the widefield microscope.
Materials
| Reagents | |||
| Tetramethylrhodamine, Methyl Ester, Perchlorate (TMRM) | ThermoFisher Scientific | T668 | |
| CM-H2DCFDA (General Oxidative Stress Indicator) | ThermoFisher Scientific | C6827 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma)Aldrich | D8418 | |
| MatriPlate 96-Well Glass Bottom MicroWell Plate 630 µL-Black 0.17 mm Low Glass Lidded | Brooks life science systems | MGB096-1-2-LG-L | |
| HBSS w/o Phenol Red 500 ml | Lonza | BE10-527F | |
| DMEM high glucose with L-glutamine | Lonza | BE12-604F | |
| Phosphate Bufered Saline (PBS) w/o Ca and Mg | Lonza | BE17-516F | |
| HEPES 1M 500mL | Lonza | 17-737F | |
| Trypsin-Versene (EDTA) Solution | Lonza | BE17-161E | |
| Cy3 AffiniPure F(ab')₂ Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson | 711-166-152 | Antibody used for acquiring flat-field image |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')₂ Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson | 711-546-152 | Antibody used for acquiring flat-field image |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Nikon Ti eclipse widefield microscope | Nikon | ||
| Perfect Focus System (PFS) | Nikon | hardware-based autofocus system | |
| CFI Plan Apo Lambda 20x objective | Nikon | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| NIS Elelements Advanced Research 4.5 with JOBS module | Nikon | This software is used to steer the microscope and program/perform the automatic image acquisition prototocol | |
| ImageJ (FIJI) Version 2.0.0-rc-43/1.50g | |||
| RStudio Version 1.0.44 | Rstudio | ||
| R version 3.3.2 |
Referências
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