Profilage Redox cellulaire utilisant une microscopie haute teneur
Summary
Cet article présente un flux de travail de microscopie à contenu élevé pour la quantification simultanée des niveaux de ROS intracellulaires, ainsi que le potentiel de la membrane mitochondriale et la morphologie – communément appelée morphofonction mitochondriale – dans les cellules adhérentes vivantes en utilisant les molécules rapporteurs fluorescentes perméables aux cellules 5- (et- 6) -chlorométhyl-2 ', 7'-dichlorodihydrofluorescéine diacétate, ester acétylique (CM-H2RFDA) et tétraméthylrhodamine méthylester (TMRM).
Abstract
Les espèces réactives d'oxygène (ROS) régulent les processus cellulaires essentiels, y compris l'expression des gènes, la migration, la différenciation et la prolifération. Cependant, les niveaux excessifs de ROS induisent un état de stress oxydatif, qui s'accompagne de dommages oxydatifs irréversibles à l'ADN, aux lipides et aux protéines. Ainsi, la quantification de ROS fournit une procuration directe pour l'état de santé cellulaire. Étant donné que les mitochondries sont parmi les principales sources et cibles cellulaires des ROS, l'analyse conjointe de la fonction mitochondriale et de la production de ROS dans les mêmes cellules est cruciale pour mieux comprendre l'interconnexion dans les pathologies physiopathologiques. Par conséquent, une stratégie basée sur la microscopie à haut contenu a été développée pour la quantification simultanée des niveaux de ROS intracellulaires, du potentiel de membrane mitochondrial (ΔΨ m ) et de la morphologie mitochondriale. Il est basé sur la microscopie de fluorescence automatisée à large champ et l'analyse d'image de cellules adhérentes vivantes, cultivées dans des plaques multi-puits, et StaineD avec les molécules rapporteurs fluorescentes perméables aux cellules CM-H 2 DCFDA (ROS) et TMRM (ΔΨ m et la morphologie mitochondriale). Contrairement à la fluorimétrie ou à la cytométrie en flux, cette stratégie permet de quantifier les paramètres subcellulaires au niveau de la cellule individuelle avec une résolution spatiotemporelle élevée, avant et après la stimulation expérimentale. Fait important, la nature basée sur l'image de la méthode permet d'extraire des paramètres morphologiques en plus des intensités de signal. Le jeu de caractéristiques combinées est utilisé pour l'analyse de données multivariées exploratoire et statistique pour détecter les différences entre les sous-populations, les types de cellules et / ou les traitements. Ici, une description détaillée de l'analyse est fournie, ainsi qu'un exemple d'expérience qui prouve son potentiel de discrimination sans équivoque entre les états cellulaires après une perturbation chimique.
Introduction
La concentration de ROS intracellulaire est méticuleusement régulée par un jeu dynamique entre les systèmes ROS produisant et ROS désactivant. Le déséquilibre entre les deux provoque un état de stress oxydatif. Parmi les principales sources de ROS sont les mitochondries 1 . Compte tenu de leur rôle dans la respiration cellulaire, ils sont responsables de la majeure partie des molécules intracellulaires de superoxyde (O 2 • – ) 2 . Cela résulte principalement de la fuite d'électrons vers O 2 au complexe 1 de la chaîne de transport d'électrons dans des conditions de potentiel de membrane mitochondrial interne négatif fort (Δψ m ), c'est-à-dire l' hyperpolarisation mitochondriale. D'autre part, la dépolarisation mitochondriale a également été corrélée avec une augmentation de la production de ROS indiquant de multiples modes d'action 3 , 4 , 5 ,> 6 , 7 , 8 . En outre, grâce à des modifications rédox dans les protéines de la machine de fusion de fission, les ROS co-régulent la morphologie mitochondriale 9. Par exemple, la fragmentation est corrélée avec l'augmentation de la production de ROS et l'apoptose 10 , 11 , alors que les mitochondries filamenteuses ont été liées à la famine et la protection des nutriments contre Mitophagie 12 . Compte tenu de la relation complexe entre les ROS cellulaires et la morphofonction mitochondriale, les deux devraient idéalement être quantifiés simultanément dans les cellules vivantes. Pour ce faire, un test d'imagerie à contenu élevé a été développé sur la base d'une microscopie à large champ automatisée et d'une analyse d'image de cultures de cellules adhérentes colorées avec les sondes fluorescentes CM-H 2 DCFDA (ROS) et TMRM (mitochondrial Δψ m et morphologie). L'imagerie à contenu élevé se réfère à l'extraction de spDes informations sur les phénotypes cellulaires à l'aide de multiples marqueurs complémentaires et des analyses d'images automatisées (notamment un grand nombre d'éléments descriptifs). Lorsqu'ils sont combinés avec un microscope automatisé, de nombreux échantillons peuvent être criblés en parallèle ( c.- à-d. Débit élevé), ce qui augmente la puissance statistique du dosage. En effet, un atout principal du protocole est qu'il permet une quantification simultanée de plusieurs paramètres dans la même cellule, et ceci pour un grand nombre de cellules et de conditions.
Le protocole est divisé en 8 parties (décrites en détail dans le protocole ci-dessous): 1) ensemencement de cellules dans une plaque à 96 puits; 2) Préparation de solutions stock, solutions de travail et tampon d'imagerie; 3) Mise en place du microscope; 4) Chargement des cellules avec CM-H 2 DCFDA et TMRM; 5) Première image en direct pour mesurer les niveaux de ROS basaux et la morphofonction mitochondriale; 6) Deuxième cycle d'imagerie en direct après addition de tert -butylePeroxyde (TBHP) pour mesurer les niveaux de ROS induits; 7) Analyse d'image automatisée; 8) Analyse des données, contrôle de la qualité et visualisation.
Le test a été développé à l'origine pour les fibroblastes cutanés humains normaux (NHDF). Étant donné que ces cellules sont grandes et plates, elles sont bien adaptées pour évaluer la morphologie mitochondriale dans les images 2D widefield 13 , 14 . Cependant, avec des modifications mineures, cette méthode s'applique à d'autres types de cellules adhérentes. De plus, à côté de la combinaison de CM-H 2 DCFDA et TMRM, le flux de travail est conforme à une variété de paires de colorants fluorescents avec différentes spécificités moléculaires 1 , 15 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Cet article décrit une méthode de microscopie à contenu élevé pour la quantification simultanée des niveaux de ROS intracellulaires et de la morphofonction mitochondriale dans le NHDF. Sa performance a été démontrée avec une étude de cas sur le NHDF traité par SQV. Les résultats confirment des preuves antérieures de la littérature dans lesquelles des niveaux accrus de ROS ou un dysfonctionnement mitochondrial ont été observés après le traitement avec des inhibiteurs de la protéase du VIH de type 1, b…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by the University of Antwerp (TTBOF/29267, TTBOF/30112), the Special Research Fund of Ghent University (project BOF/11267/09), NB-Photonics (Project code 01-MR0110) and the CSBR (Centers for Systems Biology Research) initiative from the Netherlands Organization for Scientific Research (NWO; No: CSBR09/013V). Parts of this manuscript have been adapted from another publication1, with permission of Springer. The authors thank Geert Meesen for his help with the widefield microscope.
Materials
| Reagents | |||
| Tetramethylrhodamine, Methyl Ester, Perchlorate (TMRM) | ThermoFisher Scientific | T668 | |
| CM-H2DCFDA (General Oxidative Stress Indicator) | ThermoFisher Scientific | C6827 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma)Aldrich | D8418 | |
| MatriPlate 96-Well Glass Bottom MicroWell Plate 630 µL-Black 0.17 mm Low Glass Lidded | Brooks life science systems | MGB096-1-2-LG-L | |
| HBSS w/o Phenol Red 500 ml | Lonza | BE10-527F | |
| DMEM high glucose with L-glutamine | Lonza | BE12-604F | |
| Phosphate Bufered Saline (PBS) w/o Ca and Mg | Lonza | BE17-516F | |
| HEPES 1M 500mL | Lonza | 17-737F | |
| Trypsin-Versene (EDTA) Solution | Lonza | BE17-161E | |
| Cy3 AffiniPure F(ab')₂ Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson | 711-166-152 | Antibody used for acquiring flat-field image |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')₂ Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson | 711-546-152 | Antibody used for acquiring flat-field image |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Nikon Ti eclipse widefield microscope | Nikon | ||
| Perfect Focus System (PFS) | Nikon | hardware-based autofocus system | |
| CFI Plan Apo Lambda 20x objective | Nikon | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| NIS Elelements Advanced Research 4.5 with JOBS module | Nikon | This software is used to steer the microscope and program/perform the automatic image acquisition prototocol | |
| ImageJ (FIJI) Version 2.0.0-rc-43/1.50g | |||
| RStudio Version 1.0.44 | Rstudio | ||
| R version 3.3.2 |
Referências
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