En Face Preparación de los vasos sanguíneos del ratón
Summary
Se describe un procedimiento para preparar preparaciones en la cara de la arteria carótida de ratón y la aorta. Tales preparaciones, cuando se tiñen inmunofluorescentemente con anticuerpos específicos, nos permiten estudiar la localización de proteínas y la identificación de tipos de células dentro de toda la pared vascular por microscopía confocal.
Abstract
Secciones de los tejidos embebidos en parafina se utilizan habitualmente para el estudio de histología de tejidos e histopatología. Sin embargo, es difícil determinar cuál es la morfología tridimensional del tejido de tales secciones. Además, las secciones de los tejidos examinados pueden no contener la región dentro del tejido que sea necesaria para el propósito del estudio en curso. Esta última limitación obstaculiza los estudios histopatológicos de los vasos sanguíneos ya que las lesiones vasculares se desarrollan de manera focalizada. Esto requiere un método que nos permita examinar una amplia área de la pared de los vasos sanguíneos, desde su superficie hasta regiones más profundas. Todo un montaje en la cara preparación de los vasos sanguíneos cumple con este requisito. En este artículo, vamos a demostrar cómo hacer preparaciones en la cara de la aorta del ratón y la arteria carótida y inmunofluorescentemente mancha para la microscopía confocal y otros tipos de imágenes basadas en fluorescencia.
Introduction
Para los estudios histopatológicos por microscopía óptica, se procesan rutinariamente trozos tridimensionales de tejidos biológicos para la incrustación de parafina seguido de seccionamiento y tinción. Una muestra de tejido que ha sido embebida en parafina puede ser varios milímetros en las tres dimensiones. Sin embargo, para el propósito de la microscopía óptica, debe ser primero seccionado de modo que la luz pueda pasar a través y entonces teñido de modo que la sección delgada produzca bastante contraste para la proyección de imagen. Debido a que las muestras seccionadas suelen tener un espesor de 5-10 μm, se ve sólo una fracción muy pequeña de la muestra entera en dos dimensiones a la vez. Es posible recolectar secciones secuenciales y, después de imaginar cada sección individualmente, realizar reconstrucción asistida por computadora de las imágenes 3D, pero esto es un trabajo tedioso. La histopatología de los vasos sanguíneos, especialmente para estudiar la patogénesis de la aterosclerosis, presenta problemas únicos. La aterosclerosis es una enfermedad focalizada que se desarrollaLocalmente en áreas donde se produce un flujo sanguíneo alterado. Además, la enfermedad se inicia dentro de la íntima, un tejido fino que consiste en una monocapa de células endoteliales y matriz extracelular, de grandes arterias. Por estas razones, es un reto localizar y estudiar las lesiones tempranas usando vasos sanguíneos seccionados porque uno puede faltar fácilmente seccionar la lesión. Incluso si una sección incluye un área enferma, se verá sólo una porción de 5-10 μm que contiene células endoteliales y otras células de pared vascular en los medios y adventicia.
Las preparaciones de montaje completo en la cara (pronunciado än fäs) nos permiten examinar una amplia área de la superficie del vaso sanguíneo tal como la aorta entera de la raíz aórtica hasta las arterias ilíacas comunes. Utilizando una muestra de este tipo teñida con anticuerpos específicos y otras sondas específicas, se puede señalar la ubicación de las lesiones y también donde varios eventos moleculares se producen en las células endoteliales en conjunción conLa aterogénesis tal como cambios en la expresión, localización y modificaciones postraduccionales de proteínas. Además de estudiar la aterogénesis, la forma de las células endoteliales observada en las preparaciones faciales se utiliza como un indicador del patrón regional de flujo sanguíneo promedio en el tiempo. Tales datos son importantes para estudiar la señalización mecánica de células endoteliales in situ. Para este propósito, los vasos sanguíneos histológicos transversales de corte rutinario no son útiles. Por lo tanto, para la medicina vascular y la biología, es especialmente importante adquirir una técnica para fabricar preparaciones en la cara de los vasos sanguíneos que permite observar una amplia área de la superficie del vaso, así como las áreas subsuperficiales más profundas del vaso.
Como revisado por Jelev y Surchev 1 , los biólogos vasculares han desarrollado varios métodos para observar el revestimiento de los vasos sanguíneos en la cara. Algunos métodos ingeniosos se desarrollaron en los años 1940 y 1950. Usando estos métodos, fueron Capaz de estudiar la organización fundamental de las células endoteliales que recubren la superficie interna de los vasos sanguíneos. Sin embargo, debido a la forma en que se preparan estas preparaciones de en-face (el denominado método de Hautchen 2 , 3 , 4 o desprendimiento de la superficie del recipiente 5 ) y la forma en que se tiñe la muestra, no siempre fue posible obtener muestras morfológicas ininterrumpidas Información de la superficie del vaso en las áreas más profundas de la pared de los vasos sanguíneos. La preparación completa de vasos enmarcados combinados con tinción por inmunofluorescencia nos permitió no sólo estudiar la morfología de las células endoteliales y la expresión y localización de proteínas en estas células, sino también extender dichos estudios a la región subendotelial de la pared del vaso. Los primeros estudios que usaban vasos sanguíneos en preparados para la cara manchados con inmunofluorescencia empezaron a aparecer en los años ochenta 6 ,Con el advenimiento de la microscopía confocal de barrido láser y más recientemente la microscopía multifotónica, ahora se pueden obtener imágenes claras en foco de la estructura de la pared de los vasos sanguíneos en muestras de vasos endoblados con inmunofluorescencia así como la red vascular en animales vivos 8 , 9 , 10 , 11. Estas técnicas de formación de imágenes basadas en ordenador crean imágenes seccionadas ópticamente en foco y, apilando dichas imágenes, se pueden obtener imágenes tridimensionales reconstruidas de la pared del vaso y de la red vascular en los tejidos. Puede generar imágenes de una sección hecha a lo largo del eje Z de la imagen reconstruida 12 , 13 .
En este artículo, ilustraremos un método para preparar preparaciones en la cara de la aorta de ratón y la arteria carótida para tinción inmunofluorescente. Preparaciones para el rostroPueden hacerse incluso después de que estos vasos hayan sido manipulados experimentalmente. Por ejemplo, una arteria carótida puede ser parcialmente ligada y después una preparación de cara preparada después de tal cirugía. Por esta razón, también describiremos en este artículo cómo realizamos una ligadura parcial en la arteria carótida. En comparación con la fabricación de preparaciones similares de animales más grandes tales como ratas, conejos y seres humanos, los vasos de ratón son de pequeño tamaño y más frágiles, requiriendo así un cuidado adicional durante el aislamiento quirúrgico de los vasos y preparándolos para la tinción de anticuerpos y la microscopía. Debido a que el modelo animal más utilizado para la modificación genética es el ratón, resulta crítico que muchos investigadores manejen los vasos de ratón sin dañarlos. En este manuscrito, vamos a describir cómo manejar los vasos sanguíneos del ratón cuando se hacen preparaciones en la cara de la aorta del ratón y la arteria carótida. Para fines de demostración, se utilizarán ratones C57 / b6 de tipo salvaje.
Protocol
Representative Results
Discussion
Al manejar los vasos sanguíneos del ratón, es importante recordar que el endotelio es frágil y que cualquier fuerza mecánica excesiva dañará las células endoteliales. Por ejemplo, las células endoteliales se rompen o se separan de la pared del vaso si el vaso es perfundido con demasiada fuerza, lo cual puede suceder fácilmente cuando la vasculatura se perfunda usando una jeringa manual.
Para obtener una presión de perfusión constante, utilizamos un sistema de perfusión por graved…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Las actividades de investigación de los autores están respaldadas por donaciones del Instituto Nacional de Salud al Dr. Abe (HL-130193, HL-123346, HL-118462, HL-108551).
Materials
| 0.9% Sodium Chloride injection solution USP 500ml bag | Fisher Scientific | NC9788429 |
| 12-well plates | Fisher Scientific | 12556005 |
| 6-0 coated vicryl suture | Ethicon | J833G |
| AF488 goat anti-rat IgG | Life Technologies | A11006 |
| AF546 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A11035 |
| Anti-CD144 (Ve-Cad) | BD Biosciences | BD555289 |
| Anti-VCAM-1 (H-276) Rabbit polyclonal IgG | Santa Cruze Biotechnology | Sc-8304 |
| Aoto Flow System | Braintree Scientific | EZ-AF9000 |
| Autoclave Wrap. 24x24in | Cardinal Health | 4024 |
| Blunt retractors, 2.5mm wide | Fine Science Tools | 18200-10 |
| Caprofen (Rimadyl) | zoetis | NADA#141-199 |
| Chlorhexidine Scrub, 2% | Med-Vet International | RXCHLOR2-PC |
| Curity gauze sponges 2×2 | Cardinal Health | KC2146 |
| Electric heating pad, 12X14 | Fisher Scientific | NC0667724 |
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11152-10 |
| Iris Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 |
| Micro cover glass 22x50mm | VWR | 48393059 |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-18 |
| normal goat serum | Equitech-Bio | GS05 |
| Paraformaldehyde Solution 4% in PBS | Santa Cruze Biotechnology | SC-281692 |
| Petri Dishes 100x15mm | Fisher Scientific | FB0875713 |
| Prolong Gold Antifade mountant with DAPI | Life Technologies | P-36935 |
| Puritan cortton swabs | VWR | 10806-005 |
| Puritan Mini cotton tipped aplicators | VWR | 82004-050 |
| Round handled Needle Holder | Fine Science Tools | 12076-12 |
| Silk Suture 6/0 | Fine Science Tools | 18020-60 |
| Spring scissors | ROBOZ | RS-5601 |
| Strabismus Scissors | Fine Science Tools | 14075-09 |
| Super Grip Forceps | Fine Science Tools | 00649-11 |
| Transparent Dressing | Cardinal Health | TD-26C |
| Triton X-1000 | Fisher Scientific | AC327371000 |
Referências
- Jelev, L., Surchev, L. A novel simple technique for en face endothelial observations using water-soluble media -‘thinned-wall’ preparations. J Anat. 212 (2), 192-197 (2008).
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