טיהור של ה- DNA הגנומי משקל מולקולרי גבוה מ אבקתי טחב על רצף ארוך לקריאה
Summary
Described here is a method for the extraction, purification, and quality control of genomic DNA from the obligate biotrophic fungal pathogen, powdery mildew, for use in long-read genome sequencing.
Abstract
פטריות טחב אבקה הן קבוצה של פתוגנים צמח פטרייתיים חשובים מבחינה כלכלית. יחסית מעט מאוד ידוע על הביולוגיה והגנטיקה המולקולרית של פתוגנים אלה, בין השאר בשל חוסר משאבים גנטיים גנומי מפותח. יש אורגניזמים אלה הגנום גדול, החוזרות על עצמן, אשר הפכו הגנום רצף והרכבה להחריד קשה. כאן, אנו מתארים שיטות לאיסוף, מיצוי, טיהור בקרת איכות הערכת הדנ"א הגנומי משקל מולקולרי גבוה ממיני טחב אבקה אחד, Golovinomyces cichoracearum. הפרוטוקול המתואר כולל הפרעה מכנית של נבגים ואחריו מיצוי DNA גנומי מותאם פנול / כלורופורם. תשואה אופיינית היתה DNA 7 מיקרוגרם לכל 150 נבגים מ"ג. ה- DNA הגנומי כי הוא מבודד באמצעות הליך זה מתאים רצף ארוך לקרוא (כלומר,> 48.5 KBP). אמצעי בקרת איכות על מנת להבטיח את הגודל, תשואה, וטוהר של הדנ"א הגנומי הם גםהמתוארים בשיטה זו. רצף של הדנ"א הגנומי של האיכות המתוארת כאן יאפשר ההרכבה וההשוואה של הגנום טחב אבקתי מרובה, אשר בתורו יוביל להבנה טובה יותר ושיפור שליטת הפתוגן חקלאי זה.
Introduction
קימחון הם קבוצה של צמחים biotrophic פטרייתיים לחייב פתוגנים, כאשר נלקח יחד, הם הגורם הגדול ביותר של מחלות צמחים ברחבי העולם 1. ישנם מעל 900 מינים מתוארים של טחב אבקתי, אשר קובצו טקסונומית לחמש שבטים בתוך המשפחה Erisyphaceae 2. הן בשל חשיבותה הכלכלית שלהם ואת היחסים האינטימיים שהם מפתחים עם מארחיהם, מחלות טחב אבקתי כבר נושא למחקר עבור> 100 שנים. לאחר ההדבקה, קימחון לעורר שינויים דרסטיים במבנה הסלולר, חילוף החומרים וביולוגיה מולקולרית של מארחיהם, ליהנות פתוגן זה. עם זאת, המחקר של קימחון הוא מאתגר במיוחד בשל אורח חי מחייבים שלהם, והצמיחה של הפטרייה בתרבות טהורה טרם תארה 3, 4, 5,"Xref"> 6, 7, 8. שינוי גנטי אמין ויציב של קימחון יש גם עדיין לא הושג, למרות שינוי חולף דווח בכמה מינים 9, 10.
והרצף וההרכבה של הגנום טחב אבקתי הוכיח קשים בשל מספר התכונות של הגנום עצמו. הגנום טחב אבקתי גדול (120 – 180 MBP) ביחס הגנום פטרייתיים אחר, וכולל 60 – 90% אלמנטים חוזרים מופצים באופן שווה 11. אלמנטים אלה כוללים חזרות הטרמינל הלא-ארוכות, כמו גם אלמנטים חוזרים ללא קטגוריה. שני speciales formae של מיני טחב אבקה יחידים, F graminis Blumeria. sp. hordei ו F. sp. tritici (BGH ו bgt, בהתאמה) וכן טחב אבקתי ענבים Erysiphe necator, יש דבוריםn רצף, ואת הגנום טיוטה עבור כמה אחרים הושלמו 12, 13, 14. האופי החוזר ונשנה של הגנום עשה הרכבה קשה, ואת הגנום BGH השלימה הורכב לתוך 6989 supercontigs עם L50 של 2 Mb 12.
למרות בגנום גדול, קימחון נראה שיש מספר קטן של גנים המקודדים חלבונים, עם 5845 ו 6540 גנים החזוי BGH ו bgt, בהתאמה. קימחון הרצף גם נראה חסר לפחות גני ליבה 99 כי הם חיוניים פטריות אחרות, אשר עולה בקנה אחד עם התלות של הפטריות על הצמח הפונדקאי שלהם להישרדות 11, 12, 13, 14.
רצפים חוזרים ליד telomers, צנטרומר, RN הריבוזומיתמערכי גנים ואזורים המועשרים ב מאלמנטים ניידים הם מאורגנים מן אסטרטגיות רצף קצרות לקריאה ולעתים קרובות הם תת ייצוג המכלולים הגנום 15. אזורים כאלה נחשבים אחראים רבים של הפערים המתרחשים רצפי גנום, וזה חל על הקימחון עם ההתרחבות שלהם הנרחבת של אלמנטים חוזרים 16. Highly אזורים בגנום פלסטיק נמצאים בדרך כלל באזורים חוזרים כגון 3. הם משמשים כאתר של שיחלופים כרומוזום ולעתים קרובות לקודד גנים תחת לחץ סלקטיבי חזק, כגון גנים המקודדים חלבונים מפעיל ואת הגנים המקודדים אנזימים של המטבוליזם המשני. התקדמות בטכנולוגיות סידור מולקולה בודדת לקריאה ארוכה מספקת פתרון אפשרי עבור סידור פני אזורים חוזרים של הגנום 15. לדוגמה, Faino ואח. (2015) מצאו כי ארוך רצף כולל לקרוא טכנולוגיות מטר אופטיapping מותר להם לייצר רצף הגנום פחות פער לשני זנים של דליית Verticillium הפתוגן צמח פטרייתיים, שולש שיעור רצפי DNA חוזרים בגנום, הגדלת מספר הסברי גן (וצמצום מספר סברי גן חלקי או חסר ) ו הגנום חושפני שיחלופים 17.
כדי להעסיק טכנולוגיות רצף ארוכות לקרוא אלה, ריכוזים גבוהים של הדנ"א הגנומי באיכות גבוהה, עם גדלים מינימאלי> 20 KBP, נדרשים. כאן אנו מתארים את השיטות שלנו לאיסוף נבגים, טיהור של דנ"א משקל מולקולרי גבוה מ נבגים והערכות בקרת איכות שלנו באמצעות מיני טחב אבקה Golovinomyces cichoracearum גדלו על מלפפון 18. פרוטוקול זה מבוסס על פרוטוקול שפותח בקבוצה מעבדה B. קלר (אוניברסיטת ציריך, ציריך שוויץ) 13, 19וכולל מספר שינויים שהובילו תשואות DNA מוגברות שיעור גבוה יותר של ה- DNA> 48.5 KBP בגודלם. הפרוטוקול כולל גם צעדי בקרת איכות מבוססות על המלצות מארה"ב מח' הגנום משותף אנרגיה במכון 20, 21, 22.
הפונקציה של כל מגיב הכלול במאגר תמוגה, ואת הרציונל לכל שלב טיהור, מתוארת כמו הנרי (2008) 23. פרוטוקולים שפורסמו זמין עבור בידוד של DNA גנומי משקל מולקולרי גבוה מרקמות הצמח מיקרוביאלי היו התייעץ גם בשלבי התכנון של פרוטוקול זה 24, 25, 26, 27, 28.
Protocol
Representative Results
Discussion
על מנת לקבל טהור, הדנ"א הגנומי משקל מולקולרי גבוה מן פטריות וטחב אבקתי biotrophic לחייב, גרסה שונה של השיטות שתוארו קודם לכן פותחה 30. התשואה הממוצעת באמצעות פרוטוקול מותאם זה DNA 7 מיקרוגרם לכל 150 מ"ג נבגים, הכפלה של התשואה המתקבלת עם פרוטוקול מוקדם. כמו כן, א…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This protocol was developed in support of a Joint Genome Institute-Community Sequencing Project (#1657). The work was supported in part by the Philomathia Foundation, the National Science Foundation (#0929226) and the Energy Biosciences Institute to S. Somerville; and by Swiss National Science Foundation (#310030_163260) to B. Keller. We would like to thank our colleagues, M. Figureroa and M. Miller (University of Minnesota), R. Panstruga (RWTH Aachen University), C. Pedersen (University of Copenhagen), P. Spanu (Imperial College), J. Taneja (University of California Berkeley), M. Wildermuth (University of California Berkeley), R. Wise (Iowa State University) and S. Xiao (University of Maryland) for their generous advice and for volunteering their protocols as we developed the protocol described here.
Materials
| MM400 Ball Mill | Retsch | 20.745.0001 | Or equivalent ball mill |
| 2mL tubes for ball milling | Sarstedt | 72.694.007 | |
| 5/32" stainless steel milling balls | OPS Diagnostics | GBSS 165-5000-01 | |
| Microprocessor controlled 280 Series Water Bath Preset to 65°C | Thermo Fisher Scientific | 2825 | Or equivalent water bath |
| Microprocessor controlled 280 Series Water Bath Preset to 37°C | Thermo Fisher Scientific | 2825 | Or equivalent water bath |
| Eppendorf 5417R refrigerated microcentrifuge | Krakeler Scientific | 38-022621807 | Or equivalent microcentrifuge |
| Chlorform:IAA (24:1 v/v) | Sigma-Aldrich | C0549 | Hazardous in case of skin contact or inhalation. Wear nitrile gloves, protective eyewear, lab coat and work in chemical hood |
| Phenol:Chloroform:IAA (25:24:1 v/v) | Thermo Fisher Scientific | 15593031 | Hazardous in case of skin contact or inhalation. Wear nitrile gloves, protective eyewear, lab coat and work in chemical hood |
| 100% Isopropanol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| 100% Ethanol | Sigma-Aldrich | 34923 | Chill to -20°C prior use |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| Rnase, Dnase-free (10mg/ml) | Thermo Fisher Scientific | EN0531 | |
| Potassium metabisulfite | Sigma-Aldrich | P2522 | |
| Sodium Lauryl Sacroinate | Sigma-Aldrich | L9150 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | EDS | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB) | Sigma-Aldrich | H6269 | |
| Uvex by Honeywell Futura Goggles S345C, Uvextreme | Staples | 423263 | Or equivalent eyewear |
| High Five COBALT nitrile gloves, LARGE | Neta Scientific | HFG-N193 | Or equivalent gloves |
| GelRed Nucleic Acid Gel Stain 10,000X in water | Biotium | 41003 | |
| Ethidium Bromide 10mg/ml | Biotium | 40042 | Hazardous in case of skin contact. Wear nitrile gloves and protective eyewear |
| Agarose Ultrapure Bioreagent | VWR International LLC | JT4063 | |
| GeneRuler 1kb Plus DNA Ladder | Thermo Fisher Scientific | FERSM1332 | |
| 8-48kb CHEF DNA size standards | Bio-Rad | 170-3707 | |
| Pippin Prep | Life Technologies Corporation | 4472172 | Or equivalent pulse-field gel aparatus |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 1 | Sigma-Aldrich | WHA1001042 | Or equivalent growth chamber |
| Percival Growth Chamber | Percival | AR66LXC9 | |
| NanoDrop 8000 UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-8000-GL | Or equivalent spectrophotometer |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | P11496 | |
| TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) (50X) | Thermo Fisher Scientific | B49 | Dilute 1/50 with water before use (to 1X) |
| TE Buffer | Thermo Fisher Scientific | 12090015 | |
| Tris-Borate-EDTA, 10X Solution (Electrophoresis) | Thermo Fisher Scientific | BP13334 | Dilute 1/10 with water before use (to 1X) |
| Liquid Nitrogen | Liquid nitrogen (-196 °C) is a freezing hazard. It will also expand rapidly upon warming and should not keep in a tightly closed container |
References
- Agrios, G. N. . Plant Pathology. , (1969).
- Braun, U., Cook, R. T. . Taxonomic manual of the Erysiphales (Powdery Mildews). , (2012).
- Both, M., Csukai, M., Stumpf, M. P. H., Spanu, P. D. Gene expression profiles of Blumeria graminis indicate dynamic changes to primary metabolism during development of an obligate biotrophic pathogen. Plant Cell. 17 (7), 2107-2122 (2005).
- Glawe, D. A. The powdery mildews: A review of the world’s most familiar (yet poorly known) plant pathogens. Annu Rev Phytopathol. 46, 27-51 (2008).
- Fabro, G., et al. Genome-wide expression profiling Arabidopsis at the stage of Golovinomyces cichoracearum haustorium formation. Plant Physiol. 146 (3), 1421-1439 (2008).
- Hückelhoven, R., Panstruga, R. Cell biology of the plant-powdery mildew interaction. Curr Opin Plant Biol. 14 (6), 738-746 (2011).
- Micali, C. O., Neumann, U., Grunewald, D., Panstruga, R., O’Connell, R. Biogenesis of a specialized plant-fungal interface during host cell internalization of Golovinomyces orontii haustoria. Cell Microbiol. 13 (2), 210-226 (2011).
- Chandran, D., Inada, N., Hather, G., Kleindt, C. K., Wildermuth, M. C. Laser microdissection of Arabidopsis cells at the powdery mildew infection site reveals site-specific processes and regulators. Proc Natl Acad Sci. 107 (1), 460-465 (2010).
- Spanu, P. D., Panstruga, R. Powdery mildew genomes in the crosshairs. New Phytol. 195 (1), 20-22 (2012).
- Vela-Corcía, D., Romero, D., Torés, J. A., De Vicente, A., Pérez-García, A. Transient transformation of Podosphaera xanthii by electroporation of conidia. BMC Microbiol. 15 (20), (2015).
- Hacquard, S., Francis, M. M. . Advances in Botanical Research. 70, 109-142 (2014).
- Spanu, P. D., et al. Genome expansion and gene loss in powdery mildew fungi reveal tradeoffs in extreme parasitism. Science. 330 (6010), 1543-1546 (2010).
- Wicker, T., et al. The wheat powdery mildew genome shows the unique evolution of an obligate biotroph. Nat Genet. 45 (9), 1092 (2013).
- Jones, L., et al. Adaptive genomic structural variation in the grape powdery mildew pathogen, Erysiphe necator. BMC Genomics. 15, 1081 (2014).
- Thomma, B. P. H. J., et al. Mind the gap; seven reasons to close fragmented genome assemblies. Fungal Genet Biol. 90, 24-30 (2016).
- Parlange, F., et al. A major invasion of transposable elements accounts for the large size of the Blumeria graminis f.sp. tritici genome. Funct Integr Genomics. 11, 671-677 (2011).
- Faino, L., et al. Single-molecule real-time sequencing combined with optical mapping yields completely finished fungal genome. mBio. 6, (2015).
- Adam, L., et al. Comparison of Erysiphe cichoracearum and E. cruciferarum and a survey of 360 Arabidopsis thaliana accessions for resistance to these two powdery mildew pathogens. Mol Plant Microbe In. 12 (12), 1031-1043 (1999).
- Bourras, S., et al. Multiple avirulence loci and allele-specific effector recognition control the PM3 race-specific resistance of wheat to powdery mildew. Plant Cell. 27 (10), 2991-3012 (2015).
- Henry, R. J. . Plant genotyping II: SNP technology. , (2008).
- Healey, A., Furtado, A., Cooper, T., Henry, R. J. Protocol: a simple method for extracting next-generation sequencing quality genomic DNA from recalcitrant plant species. Plant Methods. 10 (21), (2014).
- Fang, G., Hammar, S., Grumet, R. A quick and inexpensive method for removing polysaccharides from plant genomic DNA. Biotechniques. 13 (1), 52-54 (1992).
- Jordon-Thaden, I. E., Chanderbali, A. S., Gitzendanner, M. A., Soltis, D. E. Modified CTAB and TRIzol protocols improve RNA extraction from chemically complex Embryophyta. Appl Plant Sci. 3 (5), 1400105 (2015).
- Murray, M. G., Thompson, W. F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nucleic Acids Res. 8 (19), 4321-4325 (1980).
- Greco, M., Sáez, C. A., Brown, M. T., Bitonti, M. B. A simple and effective method for high quality co-extraction of genomic DNA and total RNA from low biomass Ectocarpus siliculosus, the model brown alga. PLoS One. 9 (5), e96470 (2014).
- Wilson, I. W., Schiff, C. L., Hughes, D. E., Somerville, S. C. Quantitative trait loci analysis of powdery mildew disease resistance in the Arabidopsis thaliana accession Kashmir-1. Genetics. 158 (3), 1301-1309 (2001).
