Uzun Okuma Dizi Yapmak İçin Küllemesi Yüksek Moleküler Ağırlık Genomik DNA saflaştırılması
Summary
Described here is a method for the extraction, purification, and quality control of genomic DNA from the obligate biotrophic fungal pathogen, powdery mildew, for use in long-read genome sequencing.
Abstract
külleme mantar ekonomik açıdan önemli fungal bitki patojenlerinin bir gruptur. Nispeten küçük nedeniyle iyi gelişmiş genetik ve genomik kaynak eksikliğinden kısmen, moleküler biyoloji ve bu patojenlerin genetik az şey bilinmektedir. Bu organizmalar, genom sekanslama ve montaj engelleyici zorlaştırmıştır büyük, tekrarlayan genomlara sahiptir. Burada, tek bir toz halinde küf türleri, Golovinomyces cichoracearum yüksek moleküler ağırlıklı genomik DNA toplanması, ekstraksiyon, saflaştırma ve kalite kontrol değerlendirilmesi için yöntemleri tarif eder. Açıklanan protokol, optimize edilmiş bir fenol / kloroform genomik DNA izolasyonu, ardından sporlar mekanik bozulmasını içerir. Tipik verim 150 mg konidia başına 7 ug DNA kullanılmıştır. Bu prosedür kullanılarak izole edilmektedir genomik DNA, uzun okuma sekanslama (yani> 48.5 kbp) için uygundur. Kalite kontrol önlemleri, genomik DNA'nın boyutu ile, verim ve saflığı sağlamak için de vardırBu metot dahilinde tarif. Burada tarif edilen kalite genomik DNA dizilenmesi düzeneği ve bu da daha iyi bir anlaşılmasına yol, birden çok külleme genomlarının, karşılaştırılması için izin verir ve bu tarımsal patojen kontrolü gelişmiş olur.
Introduction
Pudra küfleri zorunlu biotrophic mantar bitkinin bir grup birlikte alındığında, bitki hastalık dünya çapında 1 büyük nedenidir, bu patojenler bulunmaktadır. Taksonomik ailesi Erisyphaceae 2 içinde beş kabileler halinde gruplandırılmış olan külleme 900'ün üzerinde açıklanan türler vardır. ekonomik önemleri ve onların ana geliştirmek samimi bir ilişki için her iki dolayı, külleme hastalıkları> 100 yıldır araştırma konusu olmuştur. enfeksiyon üzerine, toz küfler bu patojenin yararlanmak için, hücreli yapının, metabolizma ve ana moleküler biyolojide önemli değişiklikler ortaya çıkarır. Bununla birlikte, toz küfü çalışma nedeniyle bunların zorunlu yaşam tarzı ve saf kültürde mantar büyümesi yapılmamış 5, 4, 3 tarif edilmemiştir için özellikle zor olduğu,"xref"> 6, 7, 8. Geçici transformasyon bazı türler 9, 10, rapor edilmiştir, ancak toz küfü güvenilir ve sabit bir genetik transformasyon ayrıca henüz gerçekleştirilmiş değildir.
külleme genomunun sıralama ve montaj nedeniyle genomun kendisinin bir dizi özellik zor olduğu kanıtlanmıştır. Diğer mantar genomların – (180 Mbp 120) göreli ve 60 oluşur – Toz halinde küf genomları büyüktür% 90 eşit olarak dağıtılmış tekrar eden kısımlar 11. Bu elemanlar, uzun terminal tekrarı, hem de edilmemiş tekrarlayan elementleri içerir. Tek külleme türleri, Blumeria graminis f iki formae SPECIALES. sp. hordei ve f. sp. tritici (BGH sırasıyla BGT) hem de üzüm külleme Erysiphe necator, arın sıralandı ve birkaç diğerleri için taslak genomları 12, 13, 14 tamamlanmıştır. Genomların tekrarlayan doğası düzeneği zorlaştırmıştır ve tamamlanan BGH genom 2 arasında bir L50 Mb 12 ile 6,989 supercontigs içine monte edilmiştir.
Büyük genomesi rağmen, toz küfler sırasıyla BGH'nin ve Bgt tahmin 5.845 ve 6,540 genleri ile, protein kodlama genlerinin az sayıda sahip gibi görünmektedir. Birbirini izleyen toz küfler de hayatta kalma 11, 12, 13, 14 ev sahibi bitki üzerinde mantar bağımlılığı ile tutarlıdır başka mantarlar içerisinde gerekli olan en az 99 çekirdek genlerden yoksun görünmektedir.
telomerlerin, sentromer, ribozomal RN yakın Tekrarlanan dizilerBir gen dizileri ve transpoze edilebilir elemanları zengin bolgelerın zayıf kısa okuma dizileme stratejilerinden monte edilir ve yeterince temsil genom tertibatları 15 genellikle edilir. Bu bölgelerin genom dizileri meydana boşlukların çok sorumlu olduğu düşünülen ve bu tekrar eden kısımlar 16 kendi geniş genişleme ile toz küfü için geçerli olan. Yüksek plastik genom bölümlerinin genellikle tekrar eden bölgeler 3 bulunmaktadır. Bunlar kromozom yeniden düzenlemelerinin bir alanı olarak hizmet ve genellikle bu efektör proteinlerini kodlayan genler ve ikincil metabolizma enzimleri kodlayan genler gibi güçlü selektif basınç altındaki genleri kodlayan. Tek moleküllü uzun okuma sekans teknolojilerini gelişmeler genomları 15 tekrarlamalı bölgelerde dizileme için potansiyel bir çözüm sağlar. Örneğin, Faino ve diğ. (2015) da dahil olmak üzere, uzun-dizi teknolojisi ve optik m okuma bulunduapping gen açıklamaları gen ek açıklama sayısını artırarak (ve kısmen sayısını azaltarak ya da eksik, genom içinde tekrar eden DNA dizilerinin oranını üçe bunları fungal bitki patojen Verticillium Dahlia iki soy için bir boşluk daha az genom dizisi üretmek için izin ) ve ortaya genom 17 yeniden düzenlemelerinin.
en az boyutları> 20 kbp bu uzun okuma dizileme teknolojileri, yüksek kaliteli, genomik DNA, yüksek konsantrasyonlarda kullanılması için, ihtiyaç vardır. Burada conidia gelen konidial toplanması, yüksek molekül ağırlıklı DNA 'nın arıtılması için yöntemleri tarif eder ve külleme türün Golovinomyces cichoracearum kullanarak kalite kontrol değerlendirmeleri salatalık 18 üzerinde büyümüş. Bu protokol B. Keller laboratuvar grubunda (Zürich Üniversitesi, Zürih İsviçre) 13, 19 geliştirilen bir protokol dayanmaktadırve artmış DNA verimlerine yol açan çok sayıda modifikasyonları ve büyüklüğü, DNA> 48.5 kbp daha yüksek bir oranını içermektedir. Protokol ayrıca Enstitüsü 20, 21, 22 Enerji Ortak Genom United States Department of tavsiyelerine göre kalite kontrol adımlarını içerir.
Liziz tamponu içerisinde yer alan her bir reaktif, ve her bir saflaştırma aşaması için mantık fonksiyonu olarak (2008) 23 Henry tarif edilmiştir. Bitki ve mikrobiyal dokularından, yüksek moleküler ağırlıklı genomik DNA'nın izolasyonu için uygun yayınlanmış protokoller bu protokol 24, 25, 26, 27, 28 tasarımında başvurulmuştur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zorunlu biotrophic külleme mantar saf, yüksek moleküler ağırlıklı genomik DNA elde etmek için, daha önce tarif edilen yöntemlerin değiştirilmiş bir versiyonu 30 geliştirilmiştir. Bu optimize edilmiş bir protokol kullanılarak ortalama verim 150 mg conidia başına 7 mg DNA, bir önceki protokol ile elde edilenin iki katıdır. Ayrıca, ortalama boyutu 48.5 kbp boyunca yaklaşık 20 kbp yükselmiştir. Bu protokol cucumber- G. cichoacearum sisteminde optimize edildi. biotr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This protocol was developed in support of a Joint Genome Institute-Community Sequencing Project (#1657). The work was supported in part by the Philomathia Foundation, the National Science Foundation (#0929226) and the Energy Biosciences Institute to S. Somerville; and by Swiss National Science Foundation (#310030_163260) to B. Keller. We would like to thank our colleagues, M. Figureroa and M. Miller (University of Minnesota), R. Panstruga (RWTH Aachen University), C. Pedersen (University of Copenhagen), P. Spanu (Imperial College), J. Taneja (University of California Berkeley), M. Wildermuth (University of California Berkeley), R. Wise (Iowa State University) and S. Xiao (University of Maryland) for their generous advice and for volunteering their protocols as we developed the protocol described here.
Materials
| MM400 Ball Mill | Retsch | 20.745.0001 | Or equivalent ball mill |
| 2mL tubes for ball milling | Sarstedt | 72.694.007 | |
| 5/32" stainless steel milling balls | OPS Diagnostics | GBSS 165-5000-01 | |
| Microprocessor controlled 280 Series Water Bath Preset to 65°C | Thermo Fisher Scientific | 2825 | Or equivalent water bath |
| Microprocessor controlled 280 Series Water Bath Preset to 37°C | Thermo Fisher Scientific | 2825 | Or equivalent water bath |
| Eppendorf 5417R refrigerated microcentrifuge | Krakeler Scientific | 38-022621807 | Or equivalent microcentrifuge |
| Chlorform:IAA (24:1 v/v) | Sigma-Aldrich | C0549 | Hazardous in case of skin contact or inhalation. Wear nitrile gloves, protective eyewear, lab coat and work in chemical hood |
| Phenol:Chloroform:IAA (25:24:1 v/v) | Thermo Fisher Scientific | 15593031 | Hazardous in case of skin contact or inhalation. Wear nitrile gloves, protective eyewear, lab coat and work in chemical hood |
| 100% Isopropanol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| 100% Ethanol | Sigma-Aldrich | 34923 | Chill to -20°C prior use |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| Rnase, Dnase-free (10mg/ml) | Thermo Fisher Scientific | EN0531 | |
| Potassium metabisulfite | Sigma-Aldrich | P2522 | |
| Sodium Lauryl Sacroinate | Sigma-Aldrich | L9150 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | EDS | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB) | Sigma-Aldrich | H6269 | |
| Uvex by Honeywell Futura Goggles S345C, Uvextreme | Staples | 423263 | Or equivalent eyewear |
| High Five COBALT nitrile gloves, LARGE | Neta Scientific | HFG-N193 | Or equivalent gloves |
| GelRed Nucleic Acid Gel Stain 10,000X in water | Biotium | 41003 | |
| Ethidium Bromide 10mg/ml | Biotium | 40042 | Hazardous in case of skin contact. Wear nitrile gloves and protective eyewear |
| Agarose Ultrapure Bioreagent | VWR International LLC | JT4063 | |
| GeneRuler 1kb Plus DNA Ladder | Thermo Fisher Scientific | FERSM1332 | |
| 8-48kb CHEF DNA size standards | Bio-Rad | 170-3707 | |
| Pippin Prep | Life Technologies Corporation | 4472172 | Or equivalent pulse-field gel aparatus |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 1 | Sigma-Aldrich | WHA1001042 | Or equivalent growth chamber |
| Percival Growth Chamber | Percival | AR66LXC9 | |
| NanoDrop 8000 UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-8000-GL | Or equivalent spectrophotometer |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | P11496 | |
| TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) (50X) | Thermo Fisher Scientific | B49 | Dilute 1/50 with water before use (to 1X) |
| TE Buffer | Thermo Fisher Scientific | 12090015 | |
| Tris-Borate-EDTA, 10X Solution (Electrophoresis) | Thermo Fisher Scientific | BP13334 | Dilute 1/10 with water before use (to 1X) |
| Liquid Nitrogen | Liquid nitrogen (-196 °C) is a freezing hazard. It will also expand rapidly upon warming and should not keep in a tightly closed container |
References
- Agrios, G. N. . Plant Pathology. , (1969).
- Braun, U., Cook, R. T. . Taxonomic manual of the Erysiphales (Powdery Mildews). , (2012).
- Both, M., Csukai, M., Stumpf, M. P. H., Spanu, P. D. Gene expression profiles of Blumeria graminis indicate dynamic changes to primary metabolism during development of an obligate biotrophic pathogen. Plant Cell. 17 (7), 2107-2122 (2005).
- Glawe, D. A. The powdery mildews: A review of the world’s most familiar (yet poorly known) plant pathogens. Annu Rev Phytopathol. 46, 27-51 (2008).
- Fabro, G., et al. Genome-wide expression profiling Arabidopsis at the stage of Golovinomyces cichoracearum haustorium formation. Plant Physiol. 146 (3), 1421-1439 (2008).
- Hückelhoven, R., Panstruga, R. Cell biology of the plant-powdery mildew interaction. Curr Opin Plant Biol. 14 (6), 738-746 (2011).
- Micali, C. O., Neumann, U., Grunewald, D., Panstruga, R., O’Connell, R. Biogenesis of a specialized plant-fungal interface during host cell internalization of Golovinomyces orontii haustoria. Cell Microbiol. 13 (2), 210-226 (2011).
- Chandran, D., Inada, N., Hather, G., Kleindt, C. K., Wildermuth, M. C. Laser microdissection of Arabidopsis cells at the powdery mildew infection site reveals site-specific processes and regulators. Proc Natl Acad Sci. 107 (1), 460-465 (2010).
- Spanu, P. D., Panstruga, R. Powdery mildew genomes in the crosshairs. New Phytol. 195 (1), 20-22 (2012).
- Vela-Corcía, D., Romero, D., Torés, J. A., De Vicente, A., Pérez-García, A. Transient transformation of Podosphaera xanthii by electroporation of conidia. BMC Microbiol. 15 (20), (2015).
- Hacquard, S., Francis, M. M. . Advances in Botanical Research. 70, 109-142 (2014).
- Spanu, P. D., et al. Genome expansion and gene loss in powdery mildew fungi reveal tradeoffs in extreme parasitism. Science. 330 (6010), 1543-1546 (2010).
- Wicker, T., et al. The wheat powdery mildew genome shows the unique evolution of an obligate biotroph. Nat Genet. 45 (9), 1092 (2013).
- Jones, L., et al. Adaptive genomic structural variation in the grape powdery mildew pathogen, Erysiphe necator. BMC Genomics. 15, 1081 (2014).
- Thomma, B. P. H. J., et al. Mind the gap; seven reasons to close fragmented genome assemblies. Fungal Genet Biol. 90, 24-30 (2016).
- Parlange, F., et al. A major invasion of transposable elements accounts for the large size of the Blumeria graminis f.sp. tritici genome. Funct Integr Genomics. 11, 671-677 (2011).
- Faino, L., et al. Single-molecule real-time sequencing combined with optical mapping yields completely finished fungal genome. mBio. 6, (2015).
- Adam, L., et al. Comparison of Erysiphe cichoracearum and E. cruciferarum and a survey of 360 Arabidopsis thaliana accessions for resistance to these two powdery mildew pathogens. Mol Plant Microbe In. 12 (12), 1031-1043 (1999).
- Bourras, S., et al. Multiple avirulence loci and allele-specific effector recognition control the PM3 race-specific resistance of wheat to powdery mildew. Plant Cell. 27 (10), 2991-3012 (2015).
- Henry, R. J. . Plant genotyping II: SNP technology. , (2008).
- Healey, A., Furtado, A., Cooper, T., Henry, R. J. Protocol: a simple method for extracting next-generation sequencing quality genomic DNA from recalcitrant plant species. Plant Methods. 10 (21), (2014).
- Fang, G., Hammar, S., Grumet, R. A quick and inexpensive method for removing polysaccharides from plant genomic DNA. Biotechniques. 13 (1), 52-54 (1992).
- Jordon-Thaden, I. E., Chanderbali, A. S., Gitzendanner, M. A., Soltis, D. E. Modified CTAB and TRIzol protocols improve RNA extraction from chemically complex Embryophyta. Appl Plant Sci. 3 (5), 1400105 (2015).
- Murray, M. G., Thompson, W. F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nucleic Acids Res. 8 (19), 4321-4325 (1980).
- Greco, M., Sáez, C. A., Brown, M. T., Bitonti, M. B. A simple and effective method for high quality co-extraction of genomic DNA and total RNA from low biomass Ectocarpus siliculosus, the model brown alga. PLoS One. 9 (5), e96470 (2014).
- Wilson, I. W., Schiff, C. L., Hughes, D. E., Somerville, S. C. Quantitative trait loci analysis of powdery mildew disease resistance in the Arabidopsis thaliana accession Kashmir-1. Genetics. 158 (3), 1301-1309 (2001).
