在嵌合斑马鱼胚胎的个别视网膜祖细胞转基因表达的体内成像来研究细胞非自治的影响
Summary
在不同的遗传背景的个体WT视网膜祖细胞的现场跟踪允许细胞非自主性的信令神经过程中贡献进行评估。这里，通过胚胎移植和体内的时间推移共焦成像的基因敲除，嵌合体的产生的组合物用于此目的。
Abstract
遗传和技术优势作出了斑马鱼脊椎动物一个关键的模式生物，其中基因操作的后果可在体内在整个快速发育期间进行跟踪。多个进程可以研究包括细胞增殖，基因表达，细胞迁移和形态发生。重要的是，嵌合体通过移植的产生可以容易地执行，允许主机环境的影响下镶嵌标签和单个细胞的跟踪。例如，通过结合宿主胚的个体移植供体细胞中有功能的基因操作（ 例如，通过显微注射吗啉）和实时成像，外在的影响，细胞非自治信号（由经遗传修饰的环境提供）进行评估。在这里，我们证明这种方法是如何使用荧光的转基因表达的开始比较作为细胞命运determin的定时的代理在通货膨胀不同的遗传主机环境。
在本文中，我们提供的协议为显微注射斑马鱼胚胎标记供体细胞，并引起在宿主胚胎的基因敲除，用于产生嵌合胚胎移植技术的说明，以及用于制备和体内的时间推移共焦运行协议多个胚胎成像。特别是，在执行多位置成像比较事件定时例如基因表达的开始时是至关重要的。这需要从多个控制和同时处理的胚胎实验数据收集。这种方法可以很容易地扩展为在任何器官或访问的实时成像选择的组织外在影响的研究，其前提是移植可根据已建立的胚胎命运地图容易定位。
Introduction
可视化在体内脊椎动物重要的发育过程的能力已经到使斑马鱼的关键模型为研究正常和疾病条件作出了贡献（在1综述，2）。具体地，神经视网膜是中枢神经系统的访问的一部分。视网膜适合于容易地进行神经发生的研究，由于其高度的组织，但结构较简单，并在脊椎动物物种3其高度保守的神经类型。细胞行为，如增殖，细胞周期出口，非对称的细胞分裂，命运规范，分化和神经电路形成的动力学可以遵循整个retinogenesis的整个过程中，这是在斑马鱼的中心视网膜由3天受精后完成（ dpf）的4，5，REF“> 6，7。
另外，在每个上述的阶段的不同基因的功能要求，可伴随地评估在斑马鱼视网膜，用其他脊椎动物模型中，表型从基因敲除技术的应用导致提供的优点只能在验尸检查评估固定的组织。特别是，使用的转基因品系中，我们可以可视化和监控荧光蛋白如在视网膜报告基因的表达，使我们能够获得underlies一个特定的神经元细胞类型的起源的基因表达的时间分辨率。由于斑马鱼的迅速发展，这些事件可以在整个发育期间被可视化，从而提供更深入了解的基因表达相对于神经元细胞身份采集和细胞行为的时间的重要性。
最后，这些方法可有效地在通过移植的产生嵌合体的斑马鱼相结合，导致分析上市基因功能的两个关键方面。首先，检查从捐赠者的胚胎，其中一个特定基因被撞倒，而他们在未标记的野生型环境中开发移植的细胞，使我们能够获得有关基因功能的细胞自主的方式相关的信息。这导致了关于它们在此。正常表达是由祖细胞，可以不再从这些基因4,6产生功能性蛋白质的发育命运结果的检查例举的祖细胞内视网膜命运决定因素的功能是重要的见解， 8,9。利用这种方法，我们已经表明，很多命运的决定性因素（ 例如，VSX1，Atoh7，Ptf1a，Barhl2）细胞的作用-autonomously推动特定视网膜神经命运;缺乏的基因表达的主要导致命运开关，使得与基因拦截的细胞保持通过采用一个备用细胞命运4，6，7，10是可行的。其次，这种嵌合的实验可用于评估时不同遗传环境中开发类型的祖细胞如何野生表现。例如，通过比较野生型细胞的发展通常表达在一WT兴趣（和报告基因）与操纵宿主环境（ 例如，基因敲除/击倒）的基因，对基因表达和细胞命运所得效果可以评估。缺乏在主机环境中的某些神经类型的，例如，已被证明在细胞非自主的方式来影响野生型祖行为，以偏压它们朝向分化成的代表性不足Ò④短缺的神经类型4，7，11，12。鉴于视网膜神经元出生在通过特定的神经元的命运决定簇的基因的顺序定时表达式（命运的基因表达）（以13中综述）保守histogenic顺序，我们使用这些方法，以说明如何命运的基因表达在野生型祖细胞的定时当这种祖细胞在诱发异常细胞组合物视网膜主机环境发展会受到影响。这里，我们概述这些方法作为证据的相对标准和广泛使用的技术的组合如何能够命运的基因表达的时机在显影视网膜祖8,9的检查。
这个协议描述了一种实验方法组合延时成像用的放心的每形成在离体显影斑马鱼胚胎移植到跟随个别mosaically标记细胞整个发育retinogenesis的整个期间。通过执行功能基因操作或在宿主胚胎，供体胚胎，两者或两者都不是，人们可以评估基因功能的细胞自主性。这种方法可广泛适用于在任何其它系统的量这里概述的各个部件都是合适的类似研究问题。
Protocol
Representative Results
Discussion
理解的程度，邻近细胞影响的关键的细胞命运决定因子的表达的定时旨在有效地指示胚胎或诱导的多能干细胞分化成特定的有丝分裂后的细胞类型或甚至图案化的组织时是必不可少的。此外，检查在活的动物的显影细胞中的这些分子事件还提供相关的动态上与体内这些事件相关的特定蜂窝上下文（时间和空间）的信息。这种研究不能在所有脊椎动物模型可以轻松实现。
<p class="jove_content"…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是由ARC DECRA到PRJ（DE120101311）和德意志研究联合会（DFG）的研究经费以LP（PO 1440 / 1-1）的支持。澳大利亚再生医学研究所是由维多利亚州政府和澳大利亚联邦政府的资金支持。我们承认杰里米·伍枝记医生，谁进行公布在箕等人在这里描述的实验。 ，2016年我们是从Higashijima教授转基因鱼的规定，感激和感谢PROFS。特纳和鲁普为提供PCS2 +质粒和威尔金森博士生成H2B-RFP和H2A-GFP构造。我们感谢FishCore设施的工作人员（莫纳什大学）采取了动物的照顾。
Materials
| Agarose | Bioline | BIO-41025 | Agarose coated dishes can be prepared a few days prior, sealed with parafilm to prevent drying and stored at 4C |
| Agarose low melt | Sigma | A9414-100G | Can be prepared in larger volume, microwaved to liquify and then kept molte in 40C waterbath. 1 ml aliquots can be prepared (one for each group of embryos mounted). |
| borosillicate glass capillary tube w/o filament | SDR Scientfic | 30-0035 | alternatives with similar diameter can be used |
| borosillicate glass capillary tube with filament | SDR Scientfic | 30-0038 | alternatives with similar diameter can be used |
| glass petri dishes (60 mm diameter) | Science Supply | 1070506 | any glass alternative of any size |
| Injection tube (2m) | Eppendorf | 524616004 | This connects the needle holder to the syringe during transplantation |
| Microinjection mold (plastic mold with wedge-shaped protrusions) | Adaptive Science Tools | PT-1 | alternatives with similar shape can be use |
| microneedle holder | Narishige | M-152 | any alternative that fits the outside diameter of the injection needles can be used |
| microinjector | Narishige or Eppendorf Femtojet | Pneumatic injector using gas pressure | |
| micromanipulator | Coherent Scientific | M330IR | similar alternatives can be used |
| microloader tip | Eppendorf | 5242956003 | |
| Mineral oil | Sigma | M5904-500ML | |
| needle puller | Sutter Instruments | Model P-2000 | Settings used for this puller are: H 430, Fil 4, Vel 50, Del 225, Pul 75. Any needle puller can be used if it results in appropriate tip dimension |
| Parafilm | Interpath | PM996 | any paraffin film |
| Pasteur pipette plastic | Samco Scientific | 202 | |
| Pasteur pipette glass | Hirschmann Laborgeraete | 9260101 | |
| Pronase | Sigma | P5942-25MG | Protease Type XIV |
| N-phenyl thiourea | Sigma | P7629-25G | PTU is toxic and can be prepared as a stock solution to avoid frequent exposure to the powder, consult MSDS before purchase / use. |
| Qiaquick gel extraction | Qiagen | 28704 | any alternatives to purify DNA can be used |
| Rneasy Mini kit | Qiagen | 74104 | any alternatives to purify RNA can be used |
| SP6 mMessage kit | Qiagen | AM1340 | any alternatives to transcribe DNA using SP6 |
Referências
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