Summary
Beteendemässiga testning används i prekliniska studier för att bedöma de fenotypiska effekterna av en sjukdom eller behandling på ett djurs välbefinnande. För att globalt bedöma motorisk funktion, vi valt tester för allmänna fortskaffningsmedel, muskelstyrka och samordning: det öppna fältet testa, testet mesh, och den rotarod testet, respektive.
Abstract
Beteendemässiga testning används i kliniska prövningar för att bedöma fenotypisk effekter och resultat som en viss sjukdom eller behandling har på djurets välbefinnande och hälsa. I området i närheten finns det ett flertal beteendemässiga tester som kan tillämpas. Vi valt ett test för allmänna fortskaffningsmedel, öppna fältet test (OFT); en test för muskelstyrka, mesh testa (MT); och ett test för samordning, rotarod testet (RR). Provning kan utföras på en veckovis eller månadsvis. Som ett test för allmänna fortskaffningsmedel, OFT verken av objektivt övervakning rörelse parametrar medan musen är i ett öppet fält apparaten. Fältet är i allmänhet en 2' x 2' låda och rörelserna registreras via laser avkänning eller videoinspelning. Musen placeras i centrera av det öppna fältet och får röra sig fritt för testet. MT använder svarstiden för en mus för att falla av en inverterad skärm som ett mått på muskelstyrka. En mus är placerad på en skärm, som är inverterad över en tydlig låda och är tidsinställda för deras latens falla. Tre studier utförs, med bästa av de tre studierna gjorde för den dagen. En poäng av 60 s är den maximala tid som en mus är kvar inverterad. Möss ges en 5-min viloperiod mellan mesh tester. Avslutningsvis bedömer en accelererad protokoll på RR finmotorik samordning och uthållighet. Under en rättegång går en mus på en roterande stav eftersom det ökar i hastighet från 4 rpm 40 rpm över 5 min. Rättegången avslutas när musen berör magnetiserade tryckgivare vid faller. Varje mus genomgår tre prövningar, och den bästa prövningen görs för den dagen. Denna kombinerade beteendemässiga data möjliggör helhetsbedömningen av rörlighet, samordning, styrka och rörlighet för försöksdjuren. Minst två av de tre åtgärderna som beteendemässiga testning måste visa förbättring för ett djur att kvalificera sig som att ha övergripande förbättrad motorik.
Introduction
Målet med beteendemässiga testning är att mäta fenotypisk karakterisering, vare sig i studier för en ny musmodell av sjukdomar som påverkar det centrala nervsystemet eller för att testa en ny behandling. I området i närheten finns det en mängd beteendemässiga tester att välja från. Motiven för att använda en kombination av beteendemässiga tester är ofta att fullt ut bedöma de prekliniska behandlingsresultat. Batteriet i beteendemässiga testning ingår häri öppna fältet testet (OFT), mesh testet (MT) och rotarod testet (RR).
OFT används som ett mått på allmänna rörelseaktivitet1,2,3,4,5,6,7. Denna bedömning gör att musen röra sig fritt i ett öppet fält, och mätningarna är förflyttning av musen under loppet av beteendemässiga rättegången. De kvantitativa analyser gjorda med hjälp av en OFT inkluderar uppfödning, avstånd flyttade, tid tillbringade rörliga (t.ex. promenader och löpning) och förändringar i aktivitet över tid (t.ex. hoppande och långsammare/hyperaktiva rörelser), vilket är varför det är en användbar och grundlig analys av gnagare beteende.
MT används för att bedöma styrkan i möss1,2,8,9,10,11. Användning av alla fyra extremiteterna att hänga utanför ett rutnät ståltrådsnät tillåter för icke-invasiv mätning av mössen förmåga att Visa ihållande lem spänningar samtidigt den motsatta effekterna av allvar. Denna bedömning görs genom att placera musen på en inverterad mesh och timing dess latens falla. Detta test bedömer musen muskulös styrka genom att mäta hur länge det kan hålla sig fast inverterad skärmen innan falla av.
RR bedömer samordning av en mus när du använder den accelererande protokoll1,2,7,8,9,12,13. Rotarod apparaten består av en cylindrisk ljusstråle som roterar i luften börjar vid 4 rpm. Musen kan lära dig detta finmotorik samordning färdighet och sedan utmanas av långsam och stegvis ökar upp till 40 rpm. Klassiskt, är protokollet konstant hastighet ett mått på muskelstyrka, medan det accelererande protokollet för RR bedömer samordning, uthållighet och muskelstyrka1,2,7, 14.
Fördelarna med dessa tre beteendemässiga tester är att de är allmänt accepterade i hela gnagare beteendemässiga testning gemenskapens2,7,8,9, och när det tas inte bara som summan av de individuella tester, men kollektivt, de kan användas som en helhetsbedömning av fenotypiska beteende när du undersöker olika utfall av experimentella behandlingar. OFT är en av de enda testerna för övergripande rörelseaktivitet2. RR är också en av de enda sätten att bedöma samordning2, annat än för att använda gait analys programvara, som inte kommer att diskuteras här. Det finns några sätt som en mus muskulös styrka kan bedömas; dock använder MT, eller en tråd hänga test, prevalently har använts i litteraturen och accepteras som en tillförlitlig metod för att testa muskelstyrka2,8,9,10, 11. många andra tekniker för att mäta allmän locomotion och samordning är extremt tidskrävande och kan inte producera tillförlitliga uppgifter (t.ex. manuellt timing musrörelser eller manuellt målning tassar för gånganalys). Automatiserade system för OFT och RR öka reliabiliteten och validiteten av uppgifterna och spara tid och ansträngning.
Till exempel skulle tanke på neurodegeneration av Sandhoff sjukdom musmodell, när du utför detta batteri av tester, OFT vara först av dessa tester används för att bedöma den motoriska avvikelser som vanligtvis ses i denna musmodell som börjar vid 3 månaders ålder. Underskott i finmotorik samordning bör också bli uppenbar början vid 12 veckors ålder. Underskott i muskelstyrka bör börja runt 14 veckors ålder, men de i slutändan blir mycket mer betydande av 16 veckor.
Dessa tester är användbara när man studerar sjukdomar som orsakar betydande motoriska försämringar, inklusive neurodegenerativa sjukdomar9 såsom Sandhoff sjukdom1,8,13, Parkinsons sjukdom7, Huntingtons sjukdom, multipel skleros. Testerna kan också användas att studera åldrande och göra jämförande geriatriska bedömningar eller mätningar av hälsa. Gait störningar och förändringar i förflyttning och balans ses i många av dessa sjukdomstillstånd. Nyttan av dessa tester är dock inte begränsad till sjukdomar med utbredd neuromuskulära symtom.
Observera att det har varit inga störande variabler noteras med avseende på motivation eller nyheten av någon av de beskrivna beteendemässiga testning åtgärderna. Det är absolut nödvändigt för vissa sjukdomstillstånd och patologier att forskarna förvärvar preliminära beteendemässiga data innan musen visar fenotypiska symtom; forskaren bör sedan regelbundet (varje vecka) säkerställa att alla motor nedskrivningar redovisas. Många sjukdomar har en snabb symtomdebut fenotypiska och utan veckans provning, dessa symtom skulle inte redovisas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla protokoll som beskrivs utfördes i enlighet med, och godkändes av, Queen's University djur eftervård kommittén. Frekvensen av beteendemässiga testning kan vara varje vecka eller månad, eller en kombination av båda (dvs vecka när man förväntar sig att se den största skillnaden och månad någon annanstans).
Obs: Murina beteendevetenskapliga studier är till stor del kön/ålder/stam-beroende, och därför är det viktigt att samla rätt tidpunkter och förbli konsekvent över experimentella grupper. Miljöfaktorer (t.ex. dofter, ljud, temperatur, luftfuktighet belysning, etc.) påverka kraftigt beteende och ångest hos möss. Försök att minska dessa miljöfaktorer som är så mycket som möjligt.
1. öppna Field Test
Obs: Före beteendemässiga testning, djuren bör vara vana att rummet där testning kommer att äga rum för 10-15 min före början av testning. Se till att lämplig personlig skyddsutrustning och alla lokala anläggning riktlinjerna följs för de beteendemässiga testprotokoll.
Obs: Ingen träning före provningen.
- Se till att datorn och OFT program, körs, och korrekt ansluten till kameran eller öppet fält box. Klicka på smartware programmet, öppna fältet ikonen och ”OK”. Valde ”digital-analog-konverterare” källan från kameraalternativ. Klicka på ”upptäckt” och kontrollera att utrymmet som helt öppet fält är visualiseras och att måtten är 30 x 30 cm.
Obs: Utrustning layout kan variera beroende på utrymmesbegränsningar, men se till att datorn och öppna fältet apparater är nära varandra i ett välupplyst rum för korrekt videoinspelning. - Klicka ”kalibrering”, ”ögonblicksbild”, och sedan ”OK” för att se till att musen är upptäcks inom ramarna för det öppna fältet. Klicka på ”tid” för att förinställa tiden att testa möss; i det här fallet in 5 min.
- Ange ämnen genom att klicka på ikonen ”subjekt”. Klicka på ”scheduler” och markera alla test försökspersoner och klicka på de dubbla gröna pilarna och ”fas ett, session en”; detta kommer att ta i alla ämnen för att börja samla in data.
- Placera musen i mitten av fältet öppna och klicka på ikonen ”start” för att be programmet att börja inspelningen. Testa bara en mus i taget.
- När 5 min är klar, kommer att programmet automatiskt flytta till nästa motiv. I det här fallet, ta bort musen som har avslutat testet och placera nästa motiv i det öppna fältet. Klicka på ”Starta”.
- Torka av utrustningen. Upprepa steg 1.3-1.4 för återstående försökspersonerna.
- För att analysera data när alla ämnen har gått igenom testning, klicka på ikonen ”analysera” överst höger på skärmen. Klicka på ”analysera” igen och sedan ”sammanfattande rapport”. Du kan också exportera data på ett USB.
2. mesh Test
Obs: Den yta och storleken av mesh på MT kan påverka prestanda. På MT, om en mus som faller inom de första 10 s under första 2 samling punkter, de kommer att sättas tillbaka på nätet omedelbart för ett andra försök. Mesh används häri var ett metallnät med mesh hål ca 1,5 mm i diameter.
Obs: Köra dessa tester under samma tid på dagen rekommenderas, eftersom fysiologiska och biokemiska parametrar fluktuera hela dagen. Kroppsvikt kan påverka prestanda i detta test och därför måste beaktas.
- Placera musen i mitten av en maska och Invertera den mesh minst 20 cm ovanför en tydlig behållare. När inverterad, starta tiduret.
- Tid och registrera tiden för fördröjning att falla. Om musen inte faller inom 60 s, ge den en poäng av 60 s och beteende inte ytterligare prövningar. Låt musen vila i minst 5 minuter. Detta är slutet av prov 1.
- Torka ner utrustningen och i pausen 5-min mellan rättegång, testa en andra mus, om det behövs. Upprepa steg 2.1-2.2 för försök 2 och 3, om det behövs (så länge musen inte poäng 60 s, det bör genomgå tre prövningar).
3. Rotarod Test
Obs: Ytan och diametern på stången på RT kan påverka prestanda. På RT, om en mus som faller inom de första 10 s under första 2 samling punkter, lägga tillbaka på staven omedelbart för ett andra försök.
Obs: Köra dessa tester under samma tid på dagen rekommenderas, eftersom fysiologiska och biokemiska parametrar fluktuera hela dagen. Kroppsvikt kan påverka prestanda i detta test och därför måste beaktas.
- Slå på IITC rotarod och dator. Se till att de är korrekt anslutna för dataregistrering.
- Kontrollera att programmet körs snabbare protokollet. Ange önskad längd på rotarod testet till xxx (giltigt intervall är 000 genom 999); i det här fallet tryck 300 *. Ange antalet körfält som ska användas till xxx (giltigt intervall är 001 genom 005); i det här fallet tryck 005 *. Som start hastigheten till xxx varvtal (ange 3005 för 5 rpms, giltigt intervall är 001 genom 045); i det här fallet tryck 004 *.
- Ange toppfarten till xxx varvtal (ange 4.030 för 30 rpms, giltigt intervall är 001 genom 045); i det här fallet tryck 040 *. Ställa in ramp hastigheten till xxx i s (ange 5,030 för en 30-s-ramp till toppfart, giltigt intervall är 000 genom 999); i detta fall tryck 300 *. Ange enhet till musläge (ange 6001 för musen framåt och 6002 för mus omvänd); i det här fallet tryck 6001 *.
- Se till att alla magnetiserade körfält är balanserade innan du börjar rättegången. Placera en mus i varje lane av rotarod.
- Tryck på start att inleda programmet. Som mössen faller, ta bort dem från deras lanes omgående för att säkerställa att de inte ”resa” de andra körfält.
- Låta mössen att vila för en 10-minuters mellan rättegång intervall. Detta är slutet av prov 1. Pausen mellan rättegång, torka ner utrustningen och börjar rättegången för nästa uppsättning av möss.
- Upprepa steg 4-6 vid behov. Om en mus ligger kvar på rotarod för full 5-min rättegång, krävs inga ytterligare studier för att musen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Studera djuren får genomgå beteendemässiga testning paradigm varje vecka eller varje månad för att tillgodose nödvändiga punkter krävs för analys. Se figur 1 för exempel på beteendemässiga testning timing. I den representativa uppgifter nedan, tagen från Osmon et al. (2016), mössen genomgick batteri beteendemässiga testning varje månad, börjar vid 12 veckors ålder, tills deras humana slutpunkten cirka 40 veckor ålder. Tidpunkten för beteendemässiga testning är ibland avgörande för ett experiment, särskilt när överlevnaden av obehandlade kontra behandlade djur varierar drastiskt och jämförelser krävs.
Även om dessa tester inte används enbart för neurodegenerativa sjukdomar, använde vi Sandhoff möss (se figur 2). Denna mus modell blir alltmer skakig och okoordinerade från 12-16 veckors ålder om obehandlade och normalt kräver dödshjälp vid 16 veckors ålder1. Data i figur 2D visar användningen av rotarod som ett medel för att se hur de behandlade möss beter sig jämfört med de normala heterozygota möss. Skillnader i de två grupperna på 40 veckor betecknar början av behandling koncernens minskad samordning jämfört med normala kontroller. I andra musmodeller där en mild fenotyp undersöks, rekommenderas ytterligare expansion och specialisering av detta batteri av tester.
När du väljer de relevanta resultat för publicering, är det viktigt att komma ihåg två huvudfaktorer. Först är att de mått som används bör vara valt att vara specifika för den djurmodell som används. I OFT, mätvärdet vanligast är ”flytta-tid” (som ses i figur 2); men är ”tillryggalagd sträcka” också ett vanligt mått för allmänna locomotion. I RR är ”slutet rpm” och ”tillryggalagd sträcka” vanliga mått. Den andra faktorn i valet av vilka mått bör väljas som ett lämpligt resultat kretsar kring vilken mått avslöjar den mest betydande divergens eller konvergens i behavioral resultat, beroende på vilket resultat förväntas.
Insamlade data kan analyseras med flera statistiska tester, men för konsekvent veckovis eller månadsvis beteendemässiga tester med samma möss, en 2-vägs upprepas-åtgärder variansanalys (2-vägs RM-ANOVA) föreslås. De upprepa åtgärderna ANOVA möjliggör längsgående bedömningen av resultaten från samma djur och tillåter för jämförelse av förändringar i djurs beteende över tid, liksom mellan grupper. Den Bonferroni korrigeringen föreslås också. När man jämför behandlingar inom den samma tidpunkt, en envägs ANOVA föreslås, som kan ses i figur 2.
Figur 1: exempel på möjliga experimentella tidslinje för beteendemässiga testning. Beteendemässiga testning kan göras med en mängd olika tidslinjer, beroende på behovet av experimentell. Testning kan göras på en månad, vecka eller kombinatoriska grund. I exemplet, studietiden varar i 23 veckor, där vecka 0 är behandling administrationen. När testning sker på månadsbasis, utförs tester på veckorna 4, 8, 12, 16 och 20. När testning sker på veckobasis, genomförs testerna varje vecka (vecka 1-22) före slutpunkten 23-veckan. När testning sker på basis av kombinatoriska, tester utförs varje vecka på veckor 1-8, och sedan tester utförs månadsvis på vecka 12, 16 och 20 innan slutpunkten 23-veckan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Månatliga beteendemässiga testning resultat där behandlade djur överträffa obehandlade djur. Vid 12 veckor överträffa behandlade djur obehandlade djur på ”tid flytta” i OFT (A) och på ”latensen falla” i MT (E). Det finns inga statistiska skillnader mellan behandlade och obehandlade djuren i ”rotarod slutet rpm” på 12 veckor (C). Över månatliga beteendemässiga testning, utför behandlade mössen samma sätt att de normala heterozygot kontrollerna i OFT (B), RR (D)och MT (F). Alla statistiska analyser genomfördes med hjälp av statistisk programvara (t.ex. GraphPad), envägs ANOVA tester utfördes på vecka 12 analys (2A, Coch E) och 2-vägs RM-ANOVA tester utfördes på den månatliga analysen ( 2b, D, och F). Alla felstaplar är SEM. Denna figur modifierad från Osmon et al. 1 och återges med tillstånd från Mary Ann Liebert Publishers, Inc. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För alla tester, rengöra och desinficera ytan för att minimera smittor och distraktorer till möss. Se också vissa att möss ges tillräckliga viloperioder mellan prövningar och beteendemässiga testar när använda OFT, RR och MT.
I OFT är det viktigt att varje mus är placerad mitt i det öppna fältet och att programmet startas vid lanseringen av musen in i centrera. Vara säker på att det finns ingen handrörelser som sensorerna kan registrera vid start programmet.
För MT är det viktigt att ha en barriär mellan mesh området där musen kommer hänga och sidorna av behållaren de faller in. Det har konstaterats att när mössen kan nå sidan av behållaren, de långsamt släppa sina främre tassar och sedan ryggen tassar för att hoppa ner. Tejpa en barriär mellan väggarna och centrera av mesh kraftigt minskar detta beteende och möjliggör ett mer exakt mått på muskelstyrka.
Ensam, är var och en av dessa tester ett bra mått för allmänna locomotion (öppna fälttest), muskulär styrka (mesh-test) och samordning (rotarod)2,7,8. Dock möjliggör sammantaget en komplett samling av dessa tre beteendemässiga tester en bred bedömning av förflyttning i möss. Denna grupp av tester bekräftar självständigt avsaknaden av störande effekter i motoriska funktionsnedsättningar på komplexa motoriska funktion. Den största begränsningen av dessa metoder är deras allmänna bedömning av förflyttning, vilket är problematiskt för extremt specifika underskott i behavioral funktion. Dessutom omfattas dessa tester, som alla beteendemässiga tester, förändringar i beteende på grund av externa faktorer, såsom ljud, förändringar i temperatur och ljus cykler. Det är klokt att upprätthålla en konsekvent extern miljö för alla försökspersoner. Detta batteri av beteendemässiga testning kan utökas för att omfatta tester för ataxi och minne. Andra metoder för att studera muskelstyrka2,8,9 inkluderar bedriver konstant varvtal RR för att korrelera muskelstyrka resultat med MT. För mer specifika bedömningar på muskelstyrka, samordning eller ataxi finns grepp styrka2 och vikter tester15 och skoparmen eller gångart analys analyser2, respektive.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill tacka The New Hope ger grunden för deras fortsatta stöd och finansiering av vår forskning. Vi vill också tacka IITC partiell finansiellt stöd för detta arbete.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IITC Life Sciences Rotarod with Series 8 computing software | IITC Life Sciences | 755 | |
| Square Open Field 45 x 45 x 40 cm (grey color). Other floor color available: white, black. | Harvard Aparatus (PanLab) | 760190 | |
| Open Field Preconfigured Module | Harvard Aparatus (PanLab) | 760688 | |
| Smart V3.0 Software Platform | Harvard Aparatus (PanLab) | 760681 | |
| Video converter (analog/digital) | Harvard Aparatus (PanLab) | 760262 | |
| Roof fixing sys for camera | Harvard Aparatus (PanLab) | 760277 | |
| Analog Sony Camera & lenseNTSC | Harvard Aparatus (PanLab) | 760505 |
References
- Osmon, K. J., et al. Systemic Gene Transfer of a Hexosaminidase Variant Using an scAAV9.47 Vector Corrects GM2 Gangliosidosis in Sandhoff Mice. Human Gene Therapy. 27 (7), 497-508 (2016).
- Brooks, S. P., Dunnett, S. B. Tests to assess motor phenotype in mice: a user's guide. Nature Reviews, Neuroscience. 10, 519-529 (2009).
- Ma, M., Basso, D. M., Walters, P., Stokes, B. T., Moser, P. Behavioural and histological outcomes following graded spinal cord contusion injury in the C57Bl/6 mouse. Exp. Neurol. 169, 239-254 (2001).
- Menalled, L. B., et al. Early motor dysfunction and striosomal distribution of huntingtin microaggregates in Huntington's disease knock-in mice. J.Neurosci. 22, 8266-8276 (2002).
- Grusser, C., Grusser-Cornehls, U. Improvement in motor performance of Weaver mutant mice following lesion of the cerebellum. Behav. Brain Res. 97, 189-194 (1998).
- De Leonibus, E., et al. Spatial deficits in a mouse model of Parkinson's disease. Psychopharmacology (Berl). 194, 517-525 (2007).
- Morris, M., Koyama, A., Masliah, E., Mucke, L. Tau Reduction Does Not Prevent Motor Deficits in Two Mouse Models of Parkinson's Disease. PLoS ONE. 6 (12), 1-7 (2011).
- Abo-ouf, A., et al. Deletion of tumour necrosis factor-α ameliorates neurodegeneration in Sandhoff disease mice. Human Molecular Genetics. , 1-16 (2013).
- Dumont, M. Behavioral Phenotyping of Mouse Models of Neurodegeneration. Neurodegeneration : Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. 793, 229-237 (2011).
- Cabe, P. A., Tilson, H. A., Mitchell, C. L., Dennis, R. A simple recording grip strength device. Pharmacol. Biochem. 8, 101-102 (1978).
- Barnēoud, P., Loliver, J., Sanger, D., Moser, P. Quantitative motor assessment in FALS mice: a longitudinal study. Neuroreport. 8, 2861-2865 (1997).
- Lui, Y., et al. Mouse model of GM2 activator deficiency manifests cerebellar pathology and motor impairment. Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 8133-8143 (1997).
- Sango, K., et al. Mouse models of Tay-Sachs and Sandhoff diseases differ in neurologic phenotype and ganglioside metabolism. Nature Genetics. 11 (2), 170-176 (1995).
- Jones, B. J., Roberts, D. J. A rotarod suitable for quantitative measurements of motor inco-ordination in naïve mice. Nauyn-Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 259 (2), 211 (1968).
- Deacon, R. M. J. Measuring the Strength of Mice. Journal of Visualized Experiments JoVE. (76), (2013).
