Único Análise Molécula do laser localizadas psoralênica adutos
Summary
Os lasers são frequentemente utilizados em estudos sobre a resposta celular a danos no ADN. No entanto, eles gerar lesões cujo espaçamento, de frequência, e colisões com garfos de replicação são raramente caracterizado. Aqui, descrevemos uma abordagem que permite a determinação destes parâmetros com a laser localizada ligações cruzadas intercadeias.
Abstract
A resposta de ADN de danos (DDR) foi extensivamente caracterizado em estudos de quebras na cadeia dupla (DSB) induzidas por irradiação com feixe de laser de micro em células vivas. A DDR de hélice distorcer modificações covalentes de ADN, incluindo ADN reticulações intercadeias (ICLs), não é bem definido. Estudamos o DDR estimulada por ICLs, localizada por fotoativação de laser de psoralenos immunotagged, nos núcleos de células vivas. A fim de abordar questões fundamentais sobre a distribuição aduto e encontros forquilha de replicação, combinamos localização laser com duas outras tecnologias. fibras de ADN são muitas vezes usadas para exibir o progresso de garfos de replicação por imunofluorescência de análogos de nucleósido incorporadas na pulsos curtos. pontos Immunoquantum têm sido amplamente empregados para uma única imagem molécula. Na nova abordagem, fibras de ADN a partir de células portadoras de laser localizada ICLs são espalhados sobre lâminas de microscópio. Os ICLs marcados são exibidos com pontos immunoquantum e the as distâncias inter-lesão determinada. colisões replicação garfo com ICLs podem ser visualizados e diferentes padrões de encontro identificados e quantificados.
Introduction
ADN está sob constante ataque de agentes exógenos, tais como a radiação, luz ultravioleta, toxinas ambientais, produtos de combustão, etc. Além disso, também é atacado por espécies de radicais endógenos produzidos pelo metabolismo oxidativo. Todos estes têm o potencial de perturbar química ou fisicamente a integridade do DNA 1. Perturbações no genoma pode ativar a resposta DNA danos (DDR), um recrutamento e modificação cascata pós translacional com centenas, se não milhares, de proteínas e microRNAs envolvidos na reparação da lesão, regulação do ciclo celular, apoptose, senescência e vias inflamatórias 2.
A maioria do nosso informações sobre o DDR vem de estudos com LAP. Isto é em grande parte devido à disponibilidade de tecnologias para a introdução de intervalos, incluindo a sequência de intervalos específicos, em ADN genómico em células vivas 3. Além disso, o propensity de quebras para induzir focos de proteínas DDR, que podem ser visualizados por imunofluorescência, tem sido muito útil para identificar a cinética e requisitos de proteínas que respondem. Uma das principais tecnologias para estudar a DDR foi introduzido por Bonner e seus colegas, que usou um feixe de laser para dirigir uma faixa de LAP em uma "região de interesse" (ROI) nos núcleos de células vivas 4. Com efeito, eles criaram um foco longa em que as proteínas do DDR puderam ser identificados por imunofluorescência. Isto foi ilustrado por sua demonstração de uma forte banda de histona H2AX fosforilada (γ-H2AX) nas células de laser exposta. Desde então, a abordagem de laser tem sido utilizada em vários estudos do DDR induzidas por LAP. Embora poderoso e popular, e da origem das imagens de imunofluorescência dramáticas, deve-se notar que na maioria dos experimentos a intensidade do laser é ajustada de modo a produzir resultados observáveis, sem preocupação com a identidade da lesão,densidade, ou espaçamento. Na verdade, pode ser difícil fazer estas estimativas. Assim, eles são largamente ignorado, apesar da multiplicidade de lesões introduzidas no ADN por lasers 5. Isso contribui para as muitas contradições na literatura 6.
Em contraste com o LAP, a maioria das modificações químicas de DNA não estimulam a formação de focos discretos de proteínas DDR. Isto é importante à luz de nossa compreensão atual das frequências de lesão. Estimou-se que as células humanas em cultura incorrer em tantos como 50 LAP por ciclo celular, em grande parte formadas durante a fase S 7, 8, 9. Menos são formadas em células não proliferantes. Isto contrasta com o número de perdas de bases nucleoticas ou eventos de modificação, que são na casa das dezenas de milhares por célula / dia 1, 10. Assim, sabemos mais sobreDDR induzida por eventos que são relativamente raros, e muito menos sobre as induzidas por lesões hélice de distorção, que no seu conjunto são muito mais comuns.
A fim de abordar questões sobre a resposta celular ao covalentes modificações do DNA genômico, queríamos trabalhar com uma hélice distorcendo aduto de DNA que tinham actividade de indução DDR inerente. Além disso, para facilitar a concepção experimental e interpretação estávamos interessados em uma estrutura cuja introdução pode ser controlada em relação ao tempo e era passível de visualização. Nesse sentido, desenvolvemos uma estratégia baseada em psoraleno. Os psoralenos são bem caracterizado intercaladores de ADN fotoactivos que favorecem 5' TA: AT locais. Ao contrário de outros agentes de reticulação, tais como mostardas de azoto e a mitomicina C (MMC) eles não são de DNA reactivo a menos expostos ao longo de onda de UV (UVA) luz. As moléculas intercalares reagir com bases de timina em cadeias opostas para produzir hélice distorcer reticulações intercadeias (ICLs) 11. Com o psoraleno trimetil usadas nas nossas experiências maior parte dos produtos são relativamente poucas, ICLs monoaductos são gerados (menos do que 10%) de 12, e ligações cruzadas entre as bases intracadeia adjacentes numa cadeia não são formados. Porque eles são blocos poderosos para a replicação e transcrição, psoraleno e outros agentes de reticulação, como cis-platina e MMC, são comumente utilizados na quimioterapia. Assim activado psoraleno estudos que se seguiram à activação da RDA por uma estrutura de distorção hélice, e também uma percepção sobre a resposta celular a um composto com importância clínica.
Nós sintetizado um reagente em que psoraleno trimetil foi ligada à digoxigenina (Dig), um esterol vegetal não encontrado em células de mamíferos e frequentemente utilizado como um immunotag. O requisito para fotoactivação permite a localização por luz laser (365 nm) de ICLs psoraleno em ROI definida em núcleos em células vivas. Estes podem ser exibidos por immunofluorescence contra a tag Dig. Reparação do ADN e proteínas de DDR apareceu nas listras do laser de localizadas ICLs 13, 14.
A DDR activado pelas intensidades elevadas laser usado para produzir LAP pode ser devido a danos isolado ou agrupado 15, 16. Por consequência, a relevância dos resultados destas experiências a lesões que ocorrem naturalmente, presentes em concentração muito mais baixa, é incerto. Para abordar questões semelhantes sobre a frequência aduto psoraleno e espaçamento no DNA, aproveitamos a tecnologia de fibra DNA 17 e pontos immunoquantum. Pontos quânticos são muito mais brilhantes do que corantes fluorescentes e não são branqueados pela exposição à luz. Assim, eles são frequentemente utilizadas para uma única molécula de imagem 18, um pedido para que os corantes fluorescentes não são suficientemente brilhante. ADN fibras individuais pode ser esticada em glass lâminas e pode ser apresentado por imunofluorescência contra análogos de nucleósido incorporadas durante incubações anteriores para a célula de colheita. Nós células tratadas com Dig-psoraleno e exposto a irradiação para ROI micro laser. As fibras foram preparados a partir das células e aductos de DIG-psoraleno individuais poderia ser visualizado com os pontos immunoquantum. A exposição das células a análogos de nucleósidos para períodos de tempo relativamente curto (20-60 minutos) permite a visualização de tractos de replicação na vizinhança dos ICLs a laser localizada.
Protocol
Representative Results
Discussion
A tecnologia de localização de laser requer o uso de células aderentes com núcleos que são visíveis em microscopia de campo claro. Tentámos para fixar as células não aderentes, tais como linfócitos primários, ou células cultivadas fracamente aderentes, tais como AD293, para a superfície de vidro com as preparações adesivas de células, tais como polilisina ou colagénio, ou misturas mais complexas. Embora esses tratamentos podem ligar-se as células à superfície, nós achamos que eles geralmente ficam a…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi apoiada em parte pelo Programa de Pesquisa Intramural do NIH, Instituto Nacional sobre o Envelhecimento (Z01 AG000746-08) e do Fundo de Investigação Anemia de Fanconi.
Materials
| Digoxigenin NHS ester | Sigma-Aldrich | 11333054001 | |
| Chloro-psoralen | Berry and Associates | PS 5000 | |
| diaminoglycol | Sigma-Aldrich | 369519 | 4,7,10-Trioxa-1,13-tridecanediamine |
| Chloroform | Acros Organics | 423550040 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A4524 | |
| Ammonium solution | Sigma-Aldrich | 5002 | |
| TLC plates | Analtech, Inc. | P02511 | |
| Flass glass column 24/40, 100ml | Chemglass Life Sciences | CG-1196-02 | |
| Nikon T2000_E2 spinning disk confocal microscope, equipped with automated stage and environmental control chamber and plate holder | Perkin Elmer | With Volocity Software | |
| Micropoint Galvo | Andor Technologies | with a Nitrogen pulsed laser | |
| dye cell | Andor Technologies | MP-2250-2-365 | |
| 365 dye | Andor Technologies | MP-27-365-DYE | |
| IdU | Sigma-Aldrich | 17125 | |
| 35mm glass botomm plates 1.5 coverslip, 10mm glass diameter, uncoated | Matek | P35G-1.5-10-C | |
| microscope slides | New Comer Supply | Part # 5070 | New Silane Slides |
| Mouse anti BrdU antibody (IdU) | BD Biosciences | 347580 | 1 in 40 |
| Rat anti BrdU Antibody (CldU) | Abcam | ab6326 | 1 in 200 |
| Rabbit anti Dig antibody | ThermoFisher Scientific | 710019 | 1 in 200 |
| Q-dot 655 goat anti Rabbit IgG | ThermoFisher Scientific | Q-11421MP | 1 in 5000 |
| AF647- goat anti Rat IgG | Jackson Immunoresearch | 112-605-167 | 1 in 100 |
| AF488-goat anti mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 115-545-166 | 1 in 100 |
| Zeiss epifluorescent microscope A200 | Zeiss | with Axiovision software | |
| Q-dot 655 filter | Chroma | 39107 |
Referências
- Lindahl, T. The Intrinsic Fragility of DNA (Nobel Lecture). Angew. Chem. Int. Ed Engl. 55 (30), 8528-8534 (2016).
- Sirbu, B. M., Cortez, D. DNA damage response: three levels of DNA repair regulation. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 5, a01272 (2013).
- Berkovich, E., Monnat, R. J., Kastan, M. B. Assessment of protein dynamics and DNA repair following generation of DNA double-strand breaks at defined genomic sites. Nat. Protoc. 3 (5), 915-922 (2008).
- Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).
- Lan, L., et al. In situ analysis of repair processes for oxidative DNA damage in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 13738-13743 (2004).
- Reynolds, P., Botchway, S. W., Parker, A. W., O’Neill, P. Spatiotemporal dynamics of DNA repair proteins following laser microbeam induced DNA damage – when is a DSB not a DSB?. Mutat. Res. 756, 14-20 (2013).
- Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. Endogenous DNA double-strand breaks: production, fidelity of repair, and induction of cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 12871-12876 (2003).
- Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. Radiation dose-rate effects, endogenous DNA damage, and signaling resonance. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 17874-17879 (2006).
- Aguilera, A., Garcia-Muse, T. Causes of genome instability. Annu. Rev. Genet. 47, 1-32 (2013).
- Swenberg, J. A., et al. Endogenous versus exogenous DNA adducts: their role in carcinogenesis, epidemiology, and risk assessment. Toxicol. Sci. 120 (1), S130-S145 (2011).
- Eichman, B. F., Mooers, B. H., Alberti, M., Hearst, J. E., Ho, P. S. The crystal structures of psoralen cross-linked DNAs: drug-dependent formation of holliday junctions. J. Mol. Biol. 308, 15-26 (2001).
- Lai, C., et al. Quantitative analysis of DNA interstrand cross-links and monoadducts formed in human cells induced by psoralens and UVA irradiation. Anal. Chem. 80, 8790-8798 (2008).
- Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation. Bioconjug. Chem. 18, 431-437 (2007).
- Muniandy, P. A., Thapa, D., Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Seidman, M. M. Repair of laser-localized DNA interstrand cross-links in G1 phase mammalian cells. J Biol. Chem. 284 (41), 27908-27917 (2009).
- Nowsheen, S., et al. Accumulation of oxidatively induced clustered DNA lesions in human tumor tissues. Mutat. Res. 674, 131-136 (2009).
- Meyer, B., et al. Clustered DNA damage induces pan-nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA-PK. Nucl Acids Res. 41, 6109-6118 (2013).
- Schwab, R. A., Niedzwiedz, W. Visualization of DNA replication in the vertebrate model system DT40 using the DNA fiber technique. J Vis. Exp. (56), e3255 (2011).
- Kad, N. M., Wang, H., Kennedy, G. G., Warshaw, D. M., Van, H. B. Collaborative dynamic DNA scanning by nucleotide excision repair proteins investigated by single- molecule imaging of quantum-dot-labeled proteins. Mol. Cell. 37 (5), 702-713 (2010).
- Spielmann, H. P., Sastry, S. S., Hearst, J. E. Methods for the large-scale synthesis of psoralen furan-side monoadducts and diadducts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (10), 4514-4518 (1992).
- Huang, J., et al. The DNA translocase FANCM/MHF promotes replication traverse of DNA interstrand crosslinks. Mol. Cell. 52, 434-446 (2013).
- Huang, J., et al. Single Molecule Analysis of Laser Localized Interstrand Crosslinks. Front Genet. 7, 84 (2016).
- Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Mol. Cell. 40, 179-204 (2010).
- Mori, T., Matsunaga, T., Hirose, T., Nikaido, O. Establishment of a monoclonal antibody recognizing ultraviolet light-induced (6-4) photoproducts. Mutat. Res. 194, 263-270 (1988).
- Poirier, M. C. Antisera specific for carcinogen-DNA adducts and carcinogen-modified DNA: applications for detection of xenobiotics in biological samples. Mutat. Res. 288, 31-38 (1993).
- Henderson, A., et al. Detection of G-quadruplex DNA in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 42, 860-869 (2014).
