الصغيرة RNA ترنسفكأيشن في الخلايا الأولية Th17 الإنسان من قبل الجيل القادم Electroporation لل
Summary
Next generation electroporation is an efficient method for transfecting human Th17 cells with small RNAs to alter gene expression and cell behavior.
Abstract
CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated from naïve CD4+ T cells in vitro by activating them in the presence of the polarizing cytokines IL-1β, IL-6, IL-23, and TGFβ. Th17 cells orchestrate immunity against extracellular bacteria and fungi, but their aberrant activity has also been associated with several autoimmune and inflammatory diseases. Th17 cells are identified by the chemokine receptor CCR6 and defined by their master transcription factor, RORγt, and characteristic effector cytokine, IL-17A. Optimized culture conditions for Th17 cell differentiation facilitate mechanistic studies of human T cell biology in a controlled environment. They also provide a setting for studying the importance of specific genes and gene expression programs through RNA interference or the introduction of microRNA (miRNA) mimics or inhibitors. This protocol provides an easy to use, reproducible, and highly efficient method for transient transfection of differentiating primary human Th17 cells with small RNAs using a next generation electroporation device.
Introduction
خلايا CD4 + T هي منسقين حاسم للاستجابة المناعية التكيفية. السذاجة خلايا CD4 + T قادرة على التطور إلى عدة خلايا التائية المستجيب مختلفة (على سبيل المثال TH1، TH2، Th17، وما إلى ذلك)، ولكل منها مجموعة خاصة بهم من السيتوكينات المميزة وعوامل النسخ، وهذا يتوقف على المكروية المحلية 1. القرارات النسب التي تجعل خلايا T حاسمة لكلا مناعة وقائية والتسامح في تقرير المصير. خلايا Th17 هي مجموعة فرعية واحدة من خلايا T المعروف لمكافحة البكتيريا خارج الخلية والفطريات، ولكن وتورط ردودهم غير لائقة أيضا في التسبب في أمراض المناعة الذاتية والتهابات متعددة مثل التصلب المتعدد والصدفية 2 و 3. خلايا Th17 الإنسان يمكن أن تتولد من خلايا CD4 + T ساذجة في المختبر عن طريق تزويدهم بيئة الاستقطاب المناسبة 4. فاريو لنا مزيج من السيتوكينات IL-1β، IL-23، وقد استخدمت TGFβ، وIL-6 لتطوير خلايا Th17 الإنسان. خلايا Th17 الإنسان تعبر عن CCR6، مستقبلات chemokine التي يشيع استخدامها لتحديد هذه الفئة من السكان الخلية ويتم تحديدها من خلال التعبير عن عامل من النسخ الرئيسي، RORγt (المشفرة بواسطة RORC) 5، 6. خلايا Th17 لديها القدرة على التعبير عن السيتوكينات متعددة، ولكن IL-17A هو المستجيب خلوى-تحديد النسب التي تنتجها هذه الخلايا. درسنا التعبير عن كل علامات المصاحب Th17 الثلاثة (CCR6، RORγt، IL-17A) لتقييم متانة لدينا البشري Th17 في المختبر التمايز الفحص. بالإضافة إلى ذلك، نحن مثقف خلايا CD4 + T البشر في ظل ظروف غير الاستقطاب، حيث تم إضافة أي السيتوكينات أو الأجسام المضادة ومنع وسائل الإعلام ثقافة لاستخدامه كقاعدة سيطرة سلبية منذ تعبير عن هذه العلامات Th17 يجب أن تكون منخفضة جدا أو غير موجودة.
ve_content "> طريقة واحدة لدراسة طبيعية تطوير خلية T الإنسان وعلم الأحياء هو التلاعب التعبير الجيني خلال تنميتها. قصيرة التدخل RNA (سيرنا) هي الاصطناعية جزيئات الحمض النووي الريبي الصغيرة التي تستهدف من mRNAs تشفير البروتين ويمكن استخدامها للحد من التعبير الجيني المحدد . MicroRNAs (miRNAs) هي الذاتية غير الترميز الرنا الصغيرة المعروفة لتعديل التعبير الجيني آخر ما بعد transcriptionally. وقد ثبت miRNAs للعب دورا هاما في كل من الفئران وبيولوجيا الخلايا T الإنسان، بما في ذلك خلايا Th17 7، 8، 9، و أمر حاسم لدينا وسائل موثوق بها من التلاعب النشاط RNA الصغيرة في خلايا T الإنسان لدراسة آثارها على التعبير الجيني وفي نهاية المطاف على بيولوجيا الخلايا T البشري. هنا، نحن تصف بروتوكول سهل الاستخدام، بما يتفق وموثوق بها التي قمنا بتطويرها لإدخال الرنا صغيرة الاصطناعية والأحماض النووية مقفل (LNAs، تعديل كيميائيا الأحماض النووية مع زيادة الاستقرار)في الخلايا المناعية، وعلى وجه التحديد إلى خلايا Th17 الإنسان.هناك عدة طرق بديلة لإدخال الرنا صغيرة في خلايا الثدييات، التي تقع عادة في فئات الكيميائية والبيولوجية، أو الفيزيائية (10). الطرق الكيميائية التي يشيع استخدامها، بما في ذلك تعداء القائم على الدهون وتعداء الكالسيوم فوسفات، تعتمد على خلق المجمعات الكيميائية DNA التي تؤخذ بشكل أكثر كفاءة من قبل الخلايا. بشكل عام، الطرق الكيميائية ليست كما فعالة لترنسفكأيشن من خلايا T الابتدائية. طريقة البيولوجي الأكثر شيوعا هو استخدام ناقلات فيروسية (مثل الفيروس الارتجاعي أو الفيروسة البطيئة)، الذي يدرج مباشرة RNA الأجانب إلى مجموعة كجزء من دورة تكرار الطبيعية. تنبيغ الفيروسية عادة ما يستغرق وقتا أطول لاستكمال، وخصوصا عندما العوامل واحد في الوقت المناسب لاستنساخ الجزيئي للالبلازميدات proviral. بالإضافة إلى ذلك، يمكن للناقلات تنبيغ الفيروسية يحتمل أن تكون ضارة للباحثين البشري. Electroporation للهو م البدنيethod على إحداث غشاء permeabilization بإخضاع الخلايا لنبضات الجهد العالي، مما يسمح الأحماض النووية لدخول عابر في الخلية حيث يمكن أن تعمل على هدفهم. وكانت الأدوات Electroporation للالتقليدية غير فعالة لtransfecting الخلايا الليمفاوية الأولية. ومع ذلك، فقد ثبت الأمثل Electroporation للجيل القادم لتكون قادرة على transfecting خلايا T في كفاءة عالية جدا، وخصوصا عندما المواد التي سيتم transfected هو RNA الصغيرة. يستخدم الجيل القادم مصطلح فضفاض إلى التفريق بين أحدث منصات (على سبيل المثال، النيون، Amaxa) من آلات Electroporation للالتقليدية. بالإضافة إلى ذلك، وهذه الطريقة قابلة بسهولة للشاشات الإنتاجية المعتدلة مع ما يصل إلى ما يقرب من 120 الرنا صغيرة في تجربة واحدة، وغالبا ما تستخدم المواد الكيميائية الاصطناعية التحقق من صحتها. الأهم من ذلك، تعداء الناجح لا يمكن أن يتحقق في اقل من 16 ساعة بعد تفعيل الخلايا التائية. وعيب هذه الطريقة، ومع ذلك، هو أنه لا يؤدي إلى incorporati الجينومية مستقرةعلى، وبالتالي فهو عابر. وبالتالي، فإن الأمر يستحق مزيدا من الجهد لخلق بناء التعبير مستقرة والتي يمكن تعبئتها في ناقلات فيروسية وأعرب بنجاح في خلايا T في الحالات التي تتطلب التعبير على المدى الطويل من الحمض النووي الريبي الصغيرة.
لقد استخدمت ترنسفكأيشن الجيل القادم (على سبيل المثال، النيون) لتسليم متنوعة RNA أو قليل النوكليوتيد LNA أدوات احدة أو المزدوج تقطعت بهم السبل الاصطناعية لأغراض مختلفة 11 و 12 و 13. تدخل RNA كفاءة يمكن أن يتسبب في الماوس الأساسي وخلايا T الإنسان باستخدام RNA المزدوج تقطعت بهم السبل التدخل القصير (سيرنا). يصف هذا البروتوكول الظروف الأمثل لاستخدام هذه التقنية في خلايا Th17 الإنسان. بالإضافة إلى الرناوات siRNAs، وهي متاحة تجاريا يحاكي ميرنا الاصطناعية ومثبطات يمكن استخدامها لدراسة مكاسب ميرنا وفقدان الوظيفة. يحاكي ميرنا هي المزدوج تقطعت بهم السبل جزيئات الحمض النووي الريبي مشابهة جدا لالرناوات siRNAs، ولكن المصممد مع تسلسل miRNAs ناضجة الذاتية. مثبطات ميرنا وكيميائيا تعديل-RNA و / أو LNA أساس أليغنوكليوتيد واحدة الذين تقطعت بهم السبل التي تربط لmiRNAs الأم واستعداء وظيفتها. لقد وجدنا أن جميع هذه الأدوات يمكن استخدامها بشكل فعال في الخلايا الليمفاوية T الأساسي مثقف، بما في ذلك ولكن لا تقتصر على خلايا Th17 الإنسان.
Protocol
Representative Results
Discussion
يوفر هذا البروتوكول وسيلة إيجابية للتسليم الرنا صغيرة إلى خلايا Th17 الإنسان. رغم استخدام خلايا Th17 الإنسان هنا، وهذه الطريقة من Electroporation للمع الرنا صغيرة يمكن استخدامها مع غيرها من مجموعات فرعية المساعد الإنسان الأساسي T، مثل TH1، TH2، وTregs. لم يعمل جيدا لخلايا CD4 + T ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the US National Institutes of Health grants (R01HL109102, P01HL107202, U19CA179512, F31HL131361), a Leukemia & Lymphoma Society scholar award (K.M.A.), and the National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) Medical Scientist Training Program (Grant #T32GM007618) (M.M.).
Materials
| anti-human IL-17A PE | ebioscience | 12-7179-42 | Clone: eBio64DEC17 |
| anti-human IFNg FITC | ebioscience | 11-7319-82 | Clone: 4S.B3 |
| anti-human CD4 eVolve605 | ebioscience | 83-0047-42 | Clone: SK3 |
| mouse anti-human CD196 (CCR6) BV421 | BD biosciences | 562515 | Clone: 11A9 |
| anti-human RORgt AF647 | BD biosciences | 563620 | Clone: Q21-559 |
| anti-human CD45 eFluor450 | ebioscience | 48-9459-42 | Clone: 2D1 |
| Foxp3/Trascription Factor Staining Buffer Set | ebioscience | 00-5523-00 | For intracellular transcription factor flow cytometry staining |
| Hu FcR Binding Inhibitor Purified | ebioscience | 14-9161-71 | |
| ImmunoCult-XF T Cell Expansion Medium | Stemcell Technologies | 10981 | "Serum-Free Base Media" |
| MACS CD28 pure functional grade, human | Miltenyi Biotec | 130-093-375 | Clone: 15E8 |
| anti-human CD3 Purified | UCSF monoclonal antibody core | N/A | Clone: OKT-3 |
| LEAF purified anti-human IL-4 | Biolegend | 500815 | Clone: MP4-25D2 |
| anti-human IFNg, functional grade purified | ebioscience | 16-7318-85 | Clone: NIB42 |
| Recombinant human IL-23 | Peprotech | 200-23 | |
| Recombinant human IL-1β | Peprotech | 200-01B | |
| Recombinant human TGF-β1 | Peprotech | 100-21C | |
| Recombinant human IL-6 | Peprotech | 200-06 | |
| siGENOME Control Pool, Non-targeting #2 | Dharmacon | D-001206-14-05 | |
| siGENOME SMARTpool Human RORC | Dharmacon | M-003442-00 | |
| siGENOME SMARTpool Human PTPRC | Dharmacon | M-008067-01 | |
| Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit | ThermoFisher Scientific | 11346D | Human CD4+ T cell Isolation Kit |
| Neon Tranfection System | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | Next generation electroporation instrument |
| Neon Tranfection System 10 μl Kit | ThermoFisher Scientific | MPK1096 | |
| Resuspension Buffer T | ThermoFisher Scientific | Provided in kit (MPK1096) | "Transfection Resuspension Buffer" |
| Lymphoprep | Stemcell Technologies | #07801 | Density Gradient Medium |
| costar 6-well tissue culture treated plates | Corning | 3516 | flat bottom plates |
| costar 48-well tissue culture treated plates | Corning | 3548 | flat bottom plates |
| BD Pharm Lyse lysing buffer, 10 X | BD biosciences | 555899 | Must make 1X solution with distilled water prior to use |
Referências
- Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of Effector CD4 T Cell Populations*. Ann Rev Immunol. 28 (1), 445-489 (2010).
- Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. IL-17 and Th17 Cells. Ann Rev Immunol. 27 (1), 485-517 (2009).
- Gaffen, S. L., Jain, R., Garg, A. V., Cua, D. J. The IL-23-IL-17 immune axis: from mechanisms to therapeutic testing. Nature. 14 (9), 585-600 (2014).
- Romagnani, S., Maggi, E., Liotta, F., Cosmi, L., Annunziato, F. Properties and origin of human Th17 cells. Mol Immunol. 47 (1), 3-7 (2009).
- Acosta-Rodriguez, E. V., et al. Surface phenotype and antigenic specificity of human interleukin 17-producing T helper memory cells. Nature Immunol. 8 (6), 639-646 (2007).
- Annunziato, F., et al. Phenotypic and functional features of human Th17 cells. J Exp Med. 204 (8), 1849-1861 (2007).
- Du, C., et al. MicroRNA miR-326 regulates TH-17 differentiation and is associated with the pathogenesis of multiple sclerosis. Nature Immunol. 10 (12), 1252-1259 (2009).
- Escobar, T. M., et al. miR-155 Activates Cytokine Gene Expression in Th17 Cells by Regulating the DNA-Binding Protein Jarid2 to Relieve Polycomb-Mediated Repression. Immunity. 40 (6), 865-879 (2014).
- Wang, H., et al. Negative regulation of Hif1a expression and TH17 differentiation by the hypoxia-regulated microRNA miR-210. Nature Immunol. 15 (4), 393-401 (2014).
- Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Anal bioanal chem. 397 (8), 3173-3178 (2010).
- Steiner, D. F., et al. MicroRNA-29 Regulates T-Box Transcription Factors and Interferon-γ Production in Helper T Cells. Immunity. 35 (2), 169-181 (2011).
- Simpson, L. J., et al. A microRNA upregulated in asthma airway T cells promotes TH2 cytokine production. Nature Immunol. 15 (12), 1162-1170 (2014).
- Pua, H. H., et al. MicroRNAs 24 and 27 Suppress Allergic Inflammation and Target a Network of Regulators of T Helper 2 Cell-Associated Cytokine Production. Immunity. 44 (4), 821-832 (2016).
- Flaherty, S., Reynolds, J. M. Mouse Naïve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets. J Vis Exp. (98), (2015).
- Schumann, K., et al. Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (33), 10437-10442 (2015).
