차세대 일렉트로 차 인간 Th17 세포 작은 RNA 형질
Summary
Next generation electroporation is an efficient method for transfecting human Th17 cells with small RNAs to alter gene expression and cell behavior.
Abstract
CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated from naïve CD4+ T cells in vitro by activating them in the presence of the polarizing cytokines IL-1β, IL-6, IL-23, and TGFβ. Th17 cells orchestrate immunity against extracellular bacteria and fungi, but their aberrant activity has also been associated with several autoimmune and inflammatory diseases. Th17 cells are identified by the chemokine receptor CCR6 and defined by their master transcription factor, RORγt, and characteristic effector cytokine, IL-17A. Optimized culture conditions for Th17 cell differentiation facilitate mechanistic studies of human T cell biology in a controlled environment. They also provide a setting for studying the importance of specific genes and gene expression programs through RNA interference or the introduction of microRNA (miRNA) mimics or inhibitors. This protocol provides an easy to use, reproducible, and highly efficient method for transient transfection of differentiating primary human Th17 cells with small RNAs using a next generation electroporation device.
Introduction
CD4 + T 세포는 적응 면역 반응의 중요한 관현악입니다. 나이브 CD4 + T 세포는 여러 이펙터 T 세포 (예받은 Th1, TH2, Th17 등)로 현상 할 수있는 로컬 미세 1에 따라 특성 사이토킨 및 전사 인자의 그 자신의 세트 각각. T 세포가 만들어 계보 결정은 자기에게 모두 보호 면역 관용에 대한 중요합니다. Th17 세포 외 박테리아 및 곰팡이를 방지하기 위해 공지 된 T 세포의 서브 세트 중 하나이지만, 그 부적절한 반응은 또한 다발 경화증, 건선과 2, 3과 같이 다수의자가 면역 및 염증성 질환의 병인에 연루되어있다. 인간 Th17 세포는 적절한 환경 편광판 (4)을 제공함으로써 체외 나이브 CD4 + T 세포로부터 생성 될 수있다. 바리오 사이토 카인의 우리 조합은 IL-1β, IL-23, TGFβ, 및 IL-6는 인간의 Th17 세포의 개발을 위해 사용되어왔다. 인간 Th17 세포 CCR6, 통상이 세포 집단을 식별하는 데 사용되며, 그 주요 전사 인자 (RORC 의해 코딩) RORγt (5, 6)의 식에 의해 정의된다 케모카인 수용체 발현. Th17 세포는 여러 사이토 카인을 발현하는 능력을 가지고 있지만, IL-17A는 이들 세포에 의해 생성 된 계통 정의 이펙터 사이토 카인이다. 우리는 우리의 인간 Th17 체외 분화 분석의 견고성을 평가하기 위해 세 가지 Th17 관련 마커 (CCR6, RORγt, IL-17A)의 발현을 조사 하였다. 또한, 우리는이 Th17 마커의 발현이 매우 낮은 또는 부재이어야 이후에는 사이토 카인이나 차단 항체를 음성 대조군으로 사용하는 배지에 첨가되지 않았다 비 편광 조건 하에서 인간 CD4 + T 세포를 배양 하였다.
ve_content는 "> 정상적인 인간 T 세포의 발달 및 생물학을 연구하는 하나의 방법은 개발 중에 유전자 발현을 조작 할 수있다. 짧은 간섭 RNA (siRNA와)는 단백질을 코딩하는 mRNA를 타겟팅 특정 유전자의 발현을 감소시키기 위해 이용 될 수있는 합성 작은 RNA 분자이다 . 마이크로 RNA (miRNA가)는 포스트 – 전사적 유전자 발현을 조절하는 것으로 알려진 내인성 비 코딩 작은 RNA를이다.의 miRNAs는 Th17 전지 7, 8, 9를 포함하여 쥐와 인간 T 세포 생물학 모두에서 중요한 역할을하는 것으로 나타났다. 이는 유전자 발현에 궁극적으로 인간 T 세포 생물학에 미치는 영향을 연구하기 위해 인간 T 세포에서 작은 RNA 활동을 조작하는 신뢰할 수있는 방법을 가지고 매우 중요하다. 여기에서, 우리는 우리가 도입 용으로 개발 된, 사용하기 쉽고 일관되고 신뢰할 수있는 프로토콜을 설명 작은 합성 RNA를 잠긴 핵산 (LNA들에서는 화학적 안정성이 증가 된 핵산을 개질)면역 세포로, 특히 인간의 Th17 세포로.일반적으로, 생물 화학적 또는 물리적 카테고리 (10)에 속하는 포유 동물 세포 내로 RNA를 작은 도입 여러 다른 방법들이있다. 지질 계 형질 감염, 칼슘 포스페이트 형질 비롯한 일반적으로 사용되는 화학적 방법이 더 효율적으로 세포에 의해 흡수되는 화학-DNA 복합체를 만드는 방법에 의존한다. 일반적으로, 화학적 방법은 일차 T 세포의 형질 감염에 대해서는 비효율적이다. 가장 일반적인 생물학적 방법은 직접 자연 복제주기의 일환으로 호스트에 외국 RNA를 삽입하는 바이러스 벡터 (예 : 레트로 바이러스 또는 렌티 바이러스)를 사용하는 것입니다. 바이러스 성 전달은 일반적으로 하나가 프로 바이러스 플라스미드의 분자 클로닝 시간에 요인 특히, 완료하는 데 시간이 오래 걸립니다. 또한, 바이러스 전달 벡터는 인간의 연구자들에게 잠재적으로 해로울 수 있습니다. 전기 물리적 인 m핵산은 일시적으로 그들의 타겟에 작용할 수있는 세포에 들어갈 수 있도록, 고전압 펄스에 세포를 실시함으로써 막 permeabilization 유도 ethod. 전통적인 전기 장비는 차 림프구를 형질 감염에 효과가 없었다. 그러나, 최적화 된 차세대 전기가 작은 물질 인 RNA 형질 감염 될 때, 특히 매우 높은 효율로 T 세포를 형질 감염 할 수있는 것으로 입증되었다. 용어 차세대 느슨하게 기존의 전기 기계에서 두 개의 새로운 플랫폼 (예를 들어, 네온, Amaxa의)를 구분하는 데 사용됩니다. 또한,이 방법은 하나의 실험에서 약 120 작은 RNA를, 최대 종종 검증 합성 시약을 사용하여 함께 적당한 처리량 스크린의 확장이 용이하다. 중요한 것은, 성공적인 형질 감염은 T 세포 활성화 후 적게 16 시간 후에 달성 될 수있다. 이 방법의 단점은, 그러나, 안정한 유전자 incorporati 초래하지 않는다는 점이다에, 그리고 것은 그러므로 과도이다. 따라서, 그것은 바이러스 벡터에 패키지 성공적으로 작은 RNA의 장기 발현이 요구되는 경우에 T 세포에서 발현 할 수있는 안정적인 발현 구조를 만들 수있는 여분의 노력이 가치가있다.
우리는 서로 다른 목적으로 11, 12, 13에 대한 다양한 합성 단일 또는 이중 가닥 RNA 또는 LNA 올리고 뉴클레오티드 도구를 제공하는 차세대 형질 (예를 들어, 네온)을 사용했다. 효율적인 RNA 간섭은 이중 가닥 짧은 간섭 RNA (siRNA에)를 사용하여 기본 마우스와 인간 T 세포에서 유도 할 수있다. 이 프로토콜은 인간 Th17 세포에서이 기술을 사용하기위한 최적의 조건을 설명한다. siRNA를 외에도 시판 합성 miRNA의 모방 및 억제제 miRNA의 이득 및 기능 상실을 연구하는데 사용될 수있다. miRNA의 모방은 siRNA를 매우 유사 이중 가닥 RNA 분자하지만 고안은성숙한 miRNAs는 내생의 시퀀스 D. miRNA의 억제제는 고유의 miRNA에 결합하여 그 기능을 길항하는 RNA 및 / 또는 LNA 기초하여 단일 가닥 올리고 뉴클레오타이드를 화학적으로 변성된다. 우리는이 모든 도구가 포함 배양 차 T 림프구에서 효과적으로 사용하지만 인간 Th17 세포에 국한되지 될 수 있다는 것을 발견했다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 인간 Th17 세포로 소형의 RNA 전달하기위한 개선 된 방법을 제공한다. 인간 Th17 세포가 여기에 사용되었지만, 소형 RNA를 가진 전기의 방법은받은 Th1, TH2 및 Tregs 다른 기본 인간 T 헬퍼 집합으로 사용될 수있다. 세포가 이전에 형질 전환에 문화를 활성화해야합니다 그래서 순진한 CD4 + T 세포에 대해 잘 작동되지 않았습니다. 이 프로토콜을 위해, 우리는 먼저 더 나은 IL-17의 생산…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the US National Institutes of Health grants (R01HL109102, P01HL107202, U19CA179512, F31HL131361), a Leukemia & Lymphoma Society scholar award (K.M.A.), and the National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) Medical Scientist Training Program (Grant #T32GM007618) (M.M.).
Materials
| anti-human IL-17A PE | ebioscience | 12-7179-42 | Clone: eBio64DEC17 |
| anti-human IFNg FITC | ebioscience | 11-7319-82 | Clone: 4S.B3 |
| anti-human CD4 eVolve605 | ebioscience | 83-0047-42 | Clone: SK3 |
| mouse anti-human CD196 (CCR6) BV421 | BD biosciences | 562515 | Clone: 11A9 |
| anti-human RORgt AF647 | BD biosciences | 563620 | Clone: Q21-559 |
| anti-human CD45 eFluor450 | ebioscience | 48-9459-42 | Clone: 2D1 |
| Foxp3/Trascription Factor Staining Buffer Set | ebioscience | 00-5523-00 | For intracellular transcription factor flow cytometry staining |
| Hu FcR Binding Inhibitor Purified | ebioscience | 14-9161-71 | |
| ImmunoCult-XF T Cell Expansion Medium | Stemcell Technologies | 10981 | "Serum-Free Base Media" |
| MACS CD28 pure functional grade, human | Miltenyi Biotec | 130-093-375 | Clone: 15E8 |
| anti-human CD3 Purified | UCSF monoclonal antibody core | N/A | Clone: OKT-3 |
| LEAF purified anti-human IL-4 | Biolegend | 500815 | Clone: MP4-25D2 |
| anti-human IFNg, functional grade purified | ebioscience | 16-7318-85 | Clone: NIB42 |
| Recombinant human IL-23 | Peprotech | 200-23 | |
| Recombinant human IL-1β | Peprotech | 200-01B | |
| Recombinant human TGF-β1 | Peprotech | 100-21C | |
| Recombinant human IL-6 | Peprotech | 200-06 | |
| siGENOME Control Pool, Non-targeting #2 | Dharmacon | D-001206-14-05 | |
| siGENOME SMARTpool Human RORC | Dharmacon | M-003442-00 | |
| siGENOME SMARTpool Human PTPRC | Dharmacon | M-008067-01 | |
| Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit | ThermoFisher Scientific | 11346D | Human CD4+ T cell Isolation Kit |
| Neon Tranfection System | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | Next generation electroporation instrument |
| Neon Tranfection System 10 μl Kit | ThermoFisher Scientific | MPK1096 | |
| Resuspension Buffer T | ThermoFisher Scientific | Provided in kit (MPK1096) | "Transfection Resuspension Buffer" |
| Lymphoprep | Stemcell Technologies | #07801 | Density Gradient Medium |
| costar 6-well tissue culture treated plates | Corning | 3516 | flat bottom plates |
| costar 48-well tissue culture treated plates | Corning | 3548 | flat bottom plates |
| BD Pharm Lyse lysing buffer, 10 X | BD biosciences | 555899 | Must make 1X solution with distilled water prior to use |
Referências
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