הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח של Dynamics microtubule אסטרל הבודד שמרים ניצנים
Summary
ניצני שמרים הוא מודל יתרון לחקר הדינמיקה microtubule in vivo עקב גנטיקה חזקה שלה ואת הפשטות של שלד התא microtubule שלה. הפרוטוקול הבא מתאר כיצד להפוך ותאי שמרי התרבות, לרכוש תמונות מיקרוסקופיה confocal, וגם כמותית לנתח דינמיקת microtubule בתאים חיים שמרים.
Abstract
מיקרוטובולים דינמיים הם היסוד תהליכים תאיים רבים, ועל מדידות מדויקות של הדינמיקה microtubule יכול לספק תובנות לגבי האופן שבו תאים מווסתים תהליכים אלה וכיצד הרגולציה ההשפעה הגנטית מוטציות. כימות של דינמיקה microtubule במודלים מטזואניים יש מספר אתגרים הקשורים, כולל צפיפות ומגבלות microtubule גבוהה על מניפולציות גנטיות. לעומת זאת, המודל שמרים הניצנים מציע יתרונות כי להתגבר על אתגרים אלה. פרוטוקול זה מתאר שיטה כדי למדוד את הדינמיקה של מיקרוטובולים יחיד בתאים חיים שמרים. תאים המבטאים טובולין מתויג fluorescently הם דבקו תאי שקופית התאספו, המאפשר רכישת תמונה יציבה זמן לשגות. מדריך מפורט על מהירות גבוהה, רכישת תמונה ארבע-ממדית מסופק גם, כמו גם פרוטוקול לכימות המאפיינים של מיקרוטובולים דינמי ערימות התמונה confocal. שיטה זו, בשילוב עם גנטיקה שמרים קונבנציונאלי, Provאידו גישה מתאימה באופן ייחודי להערכת ההשפעות כמותית של רגולטורי microtubule או מוטציות המשנים את הפעילות של יחידות משנת טובולין.
Introduction
Microtubules הם פולימרי cytoskeletal עשויים יחידות משנת חלבון αβ טובולין ו משמש במגוון רחב של קשרים הסלולר, כולל הובלה תאית, חלוקת תא, morphogenesis, ואת תנועתיות. כדי לבנות רשתות microtubule לתפקידים מגוונים אלה, תאים חייבים להסדיר בזהירות היכן ומתי טופס מיקרוטובולים. תקנה זו מושגת על ידי שליטה על התגובות כי גם להרכיב יחידות משנה αβ טובולין לתוך פולימרים microtubule או מיקרוטובולים לפרק לתוך תת-יחידות חינם; זה נקרא דינמיקת microtubule.
יעד מרכזי של שדה microtubule הוא להבהיר את המנגנונים המולקולריים מווסתים דינמיקת microtubule, כולל מחקרים של תת-יחידות-טובולין αβ ורגולטורים חיצוניים אשר נקלטים על ידי טובולין ו / או מיקרוטובולים. גישה ניסיונית ומבוססת היא לשקם מערכת זו במבחנה באמצעות חלבון αβ טובולין מטוהר, לעתים קרובות combination עם רגולטורים חיצוניים מטוהרים. למרות שמדובר בגישה שימושי, ברור כי הדינמיקה microtubule במערכות מחדש שונה מאוד מזו שנצפתה תאים חיים. לדוגמה, microtubules לגדול מהר יותר להתכווץ לאט in vivo מ במבחנה. הבדלים אלה ניתן לייחס את הזמינות של רגולטורים חיצוניים ידועים 1, כמו גם לגורמים-מוגדרים עדיין בתאים. לכן, חשוב לקבוע את פעילות רגולטורי microtubule מוטנטים משבשי דינמיקה בהקשר הסלולר ילידים.
למרות מודלים מטזואניים שהוכחו המערכות מרוויחות על חקירת פונקצית microtubule וארגון מסדר גבוה, כמה חששות מעשיים קשות להגביל את השירות של מודלים אלה עבור המדידה המדויקת של דינמיקת microtubule. ראשית, המספר הגבוה של מיקרוטובולים, החל מעשרות אלפי לכל תא, מקשה בביטחוןלעקוב מיקרוטובולים בודדים לאורך זמן. מחקרים רבים בהתמודדות עם אתגר זה באמצעות הדמיה חלבונים כי למקם באופן סלקטיבי הקצוות microtubule, כגון חלבונים במשפחה מחייב-סוף (EB). עם זאת, חלבונים אלה ידועים למקם רק עד הקצה גוברת מיקרוטובולים ב metazoans 2. לכן, השירות של חלבונים אלה מוגבלים מדידה ישירות שיעורי צמיחה, תוך עקיפה בלבד למדידת היבטים אחרים של דינמיקה, כגון תדירות הקטסטרופה. שנית, למרות ההתקדמות הטכנולוגית העריכה בגנום, יצירת תאים ביציבות להביע fluorescently שכותרתו טובולין או החדרת מוטציות לתמרן טובולין או microtubule הרגולטורים סלקטיבי עדיין מהווה אתגר משמעותי. יתר על כן, נוכחותם של isotypes טובולין רב metazoans מקעקע החקר כיצד מוטציות להשפיע גני טובולין פרט.
מערכת שמרי הניצנים מספקת מספר יתרונות חשובים למדידה ב microtubu vivoדינמיקת le. שמרים יש רשת microtubule פשוטה המאפשרת הדמיה של מיקרוטובולים הפרט. בשמרים, microtubules נובע ארגון מרכזי המכונה גופי מוט ציר (SPBs), אשר מוטמעים מעטפת גרעין 3. SPBs לשמש פיגומי מתחמים קטנים טובולין γ כי nucleate מיקרוטובולים 4, 5. SPBs nucleate שתי כיתות של מיקרוטובולים, microtubules ציר ו microtubules האסטרלי. Microtubules ציר הפרויקט לתוך nucleoplasm והם חשובים עבור הצמדת הכרומוזומים באמצעות מיקרוטובולים קינטוכור לייצוב ציר דרך חופפים מיקרוטובולים interpolar 6. בניגוד לכך, פרויקט מיקרוטובולים אסטרלי החוצה לתוך cytosol והם נדירים יחסית בהשוואה לרשת הצפופה של microtubules ציר. במהלך מיטוזה, תאים טרום anaphase יש רק 1-2 מיקרוטובולים אסטרלי הבוקע משני SPB; אלה קיימים כמו שאנימיקרוטובולים ndividual ולא כמו חבילות 7. תפקידיו של מיקרוטובולים אסטרלי במהלך מיטוזה הוא להעביר את הגרעין ואת הציר לתוך הצומת בין תאי אמא ניצן, המכונים צוואר הניצן. תנועה זו כרוכה מסלולים מוגדרים היטב שיוצרים כוח על מיקרוטובולים אסטרלי, מושכים את הגרעין ואת הציר כלפי ובסופו של דבר לתוך ניצן הצוואר 8.
יתרון נוסף של המערכת שמרים הוא כלי הגנטיקה שלה, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לחקור הרגולטורים microtubule ואת יחידות משנה טובולין עם דיוק ללא תחרות. שמרים גם בעלי רפרטואר פשוט של isotypes טובולין: סינגל β טובולין גן (TUB2) ושני גני α-טובולין (TUB1 ו TUB3). מוטציות יכולות להיות הציגו בקלות לתוך הגנים הללו ולמדו ובכך באוכלוסיית טובולין הומוגנית 9, 10. ישנם מספר נרחבבונה זמינה עבור microtubules תיוג, והוא יכול להיות ממוקד אלה לשילוב בבית הלוקוסים כרומוזומליות לביטוי יציב (ראה דיון).
המטרה הכוללת של שיטה זו היא מיקרוטובולים יחיד תמונה בתאים חיים שמרים בארבעה ממדים (X, Y, Z, ו- T) למדידות ברזולוציה גבוהה של דינמיקת microtubule. שיטות לשילוב בונים עבור הביטוי המכונן, ברמה הנמוכה של טובולין שכותרתו fluorescently בתאי שמרים מתוארות. לפני הדמיה, תאים חיים הם רכובים לתוך תאי שקופיות מצופה לקטינים concanavalin א לייצב את התאים עבור הדמיה לטווח ארוך. הפרמטרים האופטימליים לרכישת תמונה, כמו גם עבודה לניתוח נתונים, מתואר גם.
Protocol
Representative Results
Discussion
המודל שמרים הניצנים מציע יתרונות גדולים לאיסוף מדיד ברזולוציה גבוהה של דינמיקת microtubule בסביבת in vivo, כולל היכולת מיקרוטובולים יחיד תמונה לאורך זמן ואת היכולת לתפעל tubulins ורגולטורי microtubule באמצעות הכלים של גנטיקת שמרים.
תאי-מצופ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים קרי בלום (אוניברסיטת צפון קרוליינה), קיונג לי (NCI), סטיבן מרקוס (קולורדו סטייט), ואת אלמר Schiebel (Universität היידלברג) על שיתוף פלסמידים FP-TUB1 שונים. אנו מודים מליסה גרדנר (אוניברסיטת מינסוטה) להכשרת אותנו בשיטת הכנה קאמרית שקופיות. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) להעניק R01GM112893-01A1 (כדי JKM) ו T32GM008730 (כדי לספירה).
Materials
| DOB (dropout bases) | Sunrise science | 1650 | |
| CSM-Leu | Sunrise science | 1005 | |
| Agar | Ameresco | N833 | |
| 100mm polystyrene plates | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| ssDNA (Samon Sperm) in sterile DiH2O | Sigma-Aldrich | D7656 | resuspend at 10 mg/mL in DiH2O. Store aliquots at -20 ºC |
| Synthetic Complete Media | Sunrise science | 1459-100 | |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | L7647 | resuspend at 2 mg/mL in DiH2O. Store aliquots at -20 ºC |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| Microscope Coverslips | Fisher Scientific | 12-541-B | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | paraffin film |
| VALAP (Equal parts of Vaseline, lanolin and paraffin) | melt at 75 ºC before use | ||
| forceps | Fisher Scientific | 16-100-106 | |
| Poyethylene glycol (PEG) 3350 | Sigma-Aldrich | 202444 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | |||
| Ti E inverted Perfect Focus microscope | Nikon Instruments | MEA53100 | |
| 1.45 NA 100x CFI Plan Apo objective | Nikon Instruments | MRD01905 | |
| Piezo electric stage | Physik Instrumente | P-736 | |
| Spinning disk scanner | Yokogawa | CSU10 | |
| Laser combiner module | Agilent Technologies | MCL400B | |
| EMCCD camera | Andor Technology | iXon Ultra 897 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| NIS Elements software | Nikon Instruments | MQS31100 | |
| Microsoft Excel software | Microsoft | ||
| MATLAB software | MathWorks, Inc | ||
| ImageJ64 | NIH | Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. | |
| Bio-Formats Importer plug-in | Open Microscopy Environment | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids | |||
| pUC19-LEU2::GFP-TUB1 | pSK1050 | reference: Song, S. and Lee, K. S. A novel function of Saccharomyces cerevisiae CDC5 in cytokinesis. J Cell Biol. 152 (3), 451-469 (2001) |
Referências
- Zanic, M., Widlund, P. O., Hyman, A. A., Howard, J. Synergy between XMAP215 and EB1 increases microtubule growth rates to physiological levels. Nat Cell Biol. 15 (6), 688-693 (2013).
- Mimori-Kiyosue, Y., Shiina, N., Tsukita, S. The dynamic behavior of the APC-binding protein EB1 on the distal ends of microtubules. Curr Biol. 10 (14), 865-868 (2000).
- Byers, B., Goetsch, L. Behavior of spindles and spindle plaques in the cell cycle and conjugation of Saccharomyces cerevisiae. J Bacteriol. 124 (1), 511-523 (1975).
- Marschall, L. G., Jeng, R. L., Mulholland, J., Stearns, T. Analysis of Tub4p, a yeast gamma-tubulin-like protein: implications for microtubule-organizing center function. J Cell Biol. 134 (2), 443-454 (1996).
- Spang, A., Geissler, S., Grein, K., Schiebel, E. gamma-Tubulin-like Tub4p of Saccharomyces cerevisiae is associated with the spindle pole body substructures that organize microtubules and is required for mitotic spindle formation. J Cell Biol. 134 (2), 429-441 (1996).
- Winey, M., Bloom, K. Mitotic spindle form and function. Genética. 190 (4), 1197-1224 (2012).
- Gupta, M. L. J., et al. beta-Tubulin C354 mutations that severely decrease microtubule dynamics do not prevent nuclear migration in yeast. Mol Biol Cell. 13 (8), 2919-2932 (2002).
- Moore, J. K., Cooper, J. A. Coordinating mitosis with cell polarity: Molecular motors at the cell cortex. Semin Cell Dev Biol. 21 (3), 283-289 (2010).
- Gartz Hanson, M., et al. Novel alpha-tubulin mutation disrupts neural development and tubulin proteostasis. Dev Biol. 409 (2), 406-419 (2016).
- Fees, C. P., Aiken, J., O’Toole, E. T., Giddings, T. H. J., Moore, J. K. The negatively charged carboxy-terminal tail of beta-tubulin promotes proper chromosome segregation. Mol Biol Cell. 27 (11), 1786-1796 (2016).
- Song, S., Lee, K. S. A novel function of Saccharomyces cerevisiae CDC5 in cytokinesis. J Cell Biol. 152 (3), 451-469 (2001).
- Knop, M., et al. Epitope tagging of yeast genes using a PCR-based strategy: more tags and improved practical routines. Yeast. 15 (10B), 963-972 (1999).
- Kosco, K. A., et al. Control of microtubule dynamics by Stu2p is essential for spindle orientation and metaphase chromosome alignment in yeast. Mol Biol Cell. 12 (9), 2870-2880 (2001).
- Toso, R. J., Jordan, M. A., Farrell, K. W., Matsumoto, B., Wilson, L. Kinetic stabilization of microtubule dynamic instability in vitro by vinblastine. Bioquímica. 32 (5), 1285-1293 (1993).
- Aiken, J., Sept, D., Costanzo, M., Boone, C., Cooper, J. A., Moore, J. K. Genome-wide analysis reveals novel and discrete functions for tubulin carboxy-terminal tails. Curr Biol. 24 (12), 1295-1303 (2014).
- Straight, A. F., Marshall, W. F., Sedat, J. W., Murray, A. W. Mitosis in living budding yeast: anaphase A but no metaphase plate. Science. 277 (5325), 574-578 (1997).
- Khmelinskii, A., Lawrence, C., Roostalu, J., Schiebel, E. Cdc14-regulated midzone assembly controls anaphase B. J Cell Biol. 177 (6), 981-993 (2007).
- Markus, S. M., Omer, S., Baranowski, K., Lee, W. L. Improved Plasmids for Fluorescent Protein Tagging of Microtubules in Saccharomyces cerevisiae. Traffic. 16 (7), 773-786 (2015).
