出芽酵母における高解像度画像と個人アストラル微小管動態の解析
Summary
出芽酵母は、その強力な遺伝学とその微小管細胞骨格のシンプルさにin vivoでの微小管ダイナミクスを研究するための有利なモデルです。以下のプロトコルを変換し、培養酵母細胞、共焦点顕微鏡画像を取得し、かつ定量的に酵母生細胞における微小管ダイナミクスを分析する方法について説明します。
Abstract
ダイナミック微小管は、多くの細胞プロセスの基本である、と微小管ダイナミクスの正確な測定は、細胞が、これらのプロセスを調節し、どのように遺伝的変異インパクトレギュレーション方法への洞察を提供することができます。後生動物モデルにおける微小管ダイナミクスの定量化は、遺伝子操作上の高い微小管の密度および制限などの関連する課題の番号を持っています。これとは対照的に、出芽酵母のモデルは、これらの課題を克服する利点を提供しています。このプロトコルは、酵母生細胞における単一微小管のダイナミクスを測定する方法を説明しています。蛍光タグ付けされたチューブリンを発現する細胞は、安定したタイムラプス画像の取得を可能にする、組み立てられたスライドチャンバーに接着されます。高速の詳細なガイドは、四次元画像の取得はまた、共焦点画像スタック内の動的微小管の特性を定量化するためのプロトコルと同様に、提供されます。この方法では、従来の酵母の遺伝学と組み合わせて、PROV定量チューブリンサブユニットの活性を変化させる微小管調節剤または変異の効果を評価するための一意に適しているアプローチのIDE。
Introduction
微小管は、αβチューブリンタンパク質サブユニットからなる細胞骨格ポリマーであり、細胞内輸送、細胞分裂、形態形成、および運動性を含む細胞状況、多種多様に使用されています。これらの多様な役割のための微小管ネットワークを構築するために、細胞は、慎重に、いつどこで微小管の形を調整する必要があります。この規則は、遊離のサブユニットに微小管ポリマーまたは逆アセンブル微小管にαβチューブリンサブユニットを組み立てるのいずれかことが反応を制御することによって達成されます。これは、微小管ダイナミクスとして知られています。
微小管分野の主要な目標は、αβチューブリンサブユニットおよび/または微小管にチューブリンと結合する外因性制御因子の研究を含む微小管ダイナミクスを調節する分子メカニズムを解明することです。十分に確立された実験的なアプローチは、多くの場合に、COM、精製αβチューブリンタンパク質を用いてインビトロでこのシステムを再構築することです精製した外因性の規制当局とbination。これは有用なアプローチではあるが、再構成されたシステムでの微小管ダイナミクス生きた細胞で観察されたものから強く異なることは明らかです。例えば、微小管は、より速く成長し、 インビトロよりもインビボにおいても遅い縮小します。これらの違いは、細胞内の既知の外因性調節因子1の可用性、ならびにまだ未定義の要因に起因し得ます。したがって、微小管の規制当局およびネイティブ細胞の状況でのダイナミクスを混乱させる変異体の活性を測定することが重要です。
後生動物モデルは、微小管機能と高次組織を調査するための有力なシステムであることが証明されているが、いくつかの実用的な懸念が厳しく、微小管ダイナミクスの正確な測定のために、これらのモデルの有用性を制限します。まず、数十からセル当たり数千人に及ぶ微小管の高い数は、それが困難な自信を持ってすることができます時間をかけて個々の微小管を追跡します。多くの研究は、エンド結合（EB）家族の中でタンパク質のような選択的に微小管の両端に局在するタンパク質を、画像化することによってこの課題に対処します。しかし、これらのタンパク質は後生動物のみ2で成長している微小管の両端に局在することが知られています。したがって、これらのタンパク質の有用性は間接的にしかそのような破局の周波数と動力学の他の側面を、測定しながら直接、増殖速度を測定するように制限されます。第二に、ゲノム編集技術の進歩にもかかわらず、安定的に蛍光標識したチューブリンを発現するかまたは選択的にチューブリンまたは微小管のレギュレータを操作するために変異を導入した細胞を作成することは重要な課題です。また、後生動物における多くのチューブリンイソ型の存在は、変異は、個々のチューブリン遺伝子に影響を与える方法の研究を混乱させる。
出芽酵母系は、in vivo microtubu に測定するために、いくつかの重要な利点を提供しますルダイナミクス。酵母は、個々の微小管の可視化を可能に簡略化微小管ネットワークを持っています。酵母では、微小管は、核膜3中に埋め込まれている紡錘体極体（のSPB）、として知られているセンターを組織から発します。 SPBは、微小管4,5の核γチューブリン小複合体のための足場として機能します。 SPBは、微小管、スピンドル微小管とアストラル微小管の2つのクラスを核形成します。核質にスピンドル微小管プロジェクトと動原体微小管を経由し、極間微小管6を重ね経由してスピンドルを安定化させるための染色体に取り付けるために重要です。対照的に外側にサイトゾルに、アストラル微小管プロジェクト及び紡錘体微小管の緻密なネットワークに比べて比較的まれです。有糸分裂の際、事前に後期の細胞は、SPBのいずれかから発せられるだけで1-2アストラル微小管を持っています。これらは私のように存在してndividual微小管ではなく、バンドル7のように。有糸分裂時のアストラル微小管の役割は、つぼみネックとして知られている母親とつぼみのコンパートメントとの間の接合部の中に核とスピンドルを移動させることです。この動きは、向かって、最終的に芽ネック8に核とスピンドルを引く、アストラル微小管に力を生成する明確に定義された経路を含みます。
酵母系の別の利点は、比類のない精度で微小管調節剤及びチューブリンサブユニットを調査するために使用することができ、その遺伝学の有用性です。単一βチューブリン遺伝子（TUB2）および2つのαチューブリン遺伝子（TUB1とTUB3）：酵母はまた、チューブリンアイソタイプの簡略化されたレパートリーを有します。変異は、容易にこれらの遺伝子に導入し、それによって均質なチューブリン集団9、10で研究することができます。広くは数多くあります利用できるラベリング微小管のための構造、およびこれらは、安定な発現のための染色体座での統合のために標的とすることができる（説明を参照）。
この方法の全体的な目標は、微小管ダイナミクスの高分解能測定のための4つの次元（X、Y、Z、およびT）で酵母細胞を生きた画像単一微小管です。酵母細胞における蛍光標識チューブリンの恒常、低レベルの発現のための構築物を統合するための方法が記載されています。撮像前に、生きている細胞は、長期的なイメージングのための細胞を安定化するためにレクチンコンカナバリンAで被覆したスライドチャンバーに取り付けられています。画像取得のための最適なパラメータ、ならびにデータ分析のためのワークフローは、また、記載されています。
Protocol
Representative Results
Discussion
出芽酵母モデルは、経時画像単一微小管に能力および酵母遺伝学のツールを使用してチューブリン及び微小管調節を操作する能力を含む、 インビボ設定において微小管ダイナミクスの高分解能測定値を収集するための主要な利点を提供します。
コンカナバリンAでコーティングされたチャンバーは、溶融寒天パッドを含む前述の装置、より多くの利点を提供します…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、様々なFP-TUB1プラスミドを共有するためのケリー・ブルーム（ノースカロライナ大学）、カイアング・リー（NCI）、スティーブン・マーカス（コロラド州立大学）、およびエルマー・シーベル（理学部ハイデルベルク）を感謝します。私たちは、スライドチャンバーの調製方法で私たちを訓練するためのメリッサ・ガードナー（ミネソタ大学）に感謝しています。この作品は、国立衛生研究所（NIH）（JKM）にR01GM112893-01A1と（CE）はT32GM008730を付与することにより、サポートされていました。
Materials
| DOB (dropout bases) | Sunrise science | 1650 | |
| CSM-Leu | Sunrise science | 1005 | |
| Agar | Ameresco | N833 | |
| 100mm polystyrene plates | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| ssDNA (Samon Sperm) in sterile DiH2O | Sigma-Aldrich | D7656 | resuspend at 10 mg/mL in DiH2O. Store aliquots at -20 ºC |
| Synthetic Complete Media | Sunrise science | 1459-100 | |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | L7647 | resuspend at 2 mg/mL in DiH2O. Store aliquots at -20 ºC |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| Microscope Coverslips | Fisher Scientific | 12-541-B | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | paraffin film |
| VALAP (Equal parts of Vaseline, lanolin and paraffin) | melt at 75 ºC before use | ||
| forceps | Fisher Scientific | 16-100-106 | |
| Poyethylene glycol (PEG) 3350 | Sigma-Aldrich | 202444 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | |||
| Ti E inverted Perfect Focus microscope | Nikon Instruments | MEA53100 | |
| 1.45 NA 100x CFI Plan Apo objective | Nikon Instruments | MRD01905 | |
| Piezo electric stage | Physik Instrumente | P-736 | |
| Spinning disk scanner | Yokogawa | CSU10 | |
| Laser combiner module | Agilent Technologies | MCL400B | |
| EMCCD camera | Andor Technology | iXon Ultra 897 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| NIS Elements software | Nikon Instruments | MQS31100 | |
| Microsoft Excel software | Microsoft | ||
| MATLAB software | MathWorks, Inc | ||
| ImageJ64 | NIH | Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. | |
| Bio-Formats Importer plug-in | Open Microscopy Environment | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids | |||
| pUC19-LEU2::GFP-TUB1 | pSK1050 | reference: Song, S. and Lee, K. S. A novel function of Saccharomyces cerevisiae CDC5 in cytokinesis. J Cell Biol. 152 (3), 451-469 (2001) |
Referências
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