उच्च संकल्प इमेजिंग और नवोदित खमीर में व्यक्तिगत एस्ट्रल सूक्ष्मनलिका गतिशीलता का विश्लेषण
Summary
नवोदित खमीर अपने शक्तिशाली आनुवंशिकी और उसके सूक्ष्मनलिका cytoskeleton की सरलता के कारण विवो में सूक्ष्मनलिका गतिशीलता के अध्ययन के लिए एक लाभप्रद मॉडल है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल का वर्णन करता है को बदलने के लिए कैसे और संस्कृति खमीर कोशिकाओं, कोंफोकल माइक्रोस्कोपी छवियों के अधिग्रहण, और मात्रात्मक खमीर कोशिकाओं में रहने वाले सूक्ष्मनलिका गतिशीलता का विश्लेषण।
Abstract
गतिशील सूक्ष्मनलिकाएं कई कोशिकीय प्रक्रियाओं के लिए मौलिक हैं, और सूक्ष्मनलिका गतिशीलता के सटीक मापन कैसे कोशिकाओं इन प्रक्रियाओं को विनियमित में और कैसे आनुवंशिक म्यूटेशनों प्रभाव विनियमन अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं। metazoan मॉडल में सूक्ष्मनलिका गतिशीलता की मात्रा एक उच्च सूक्ष्मनलिका घनत्व और आनुवंशिक जोड़तोड़ पर सीमाओं सहित जुड़े चुनौतियों, की एक संख्या है। विपरीत, नवोदित खमीर मॉडल लाभ है कि इन चुनौतियों पर काबू पाने के प्रदान करता है। यह प्रोटोकॉल खमीर कोशिकाओं में रहने वाले एक सूक्ष्मनलिकाएं की गतिशीलता को मापने के लिए एक विधि का वर्णन है। fluorescently टैग ट्यूबिलिन व्यक्त कोशिकाओं को इकट्ठा किया स्लाइड कक्षों का पालन कर रहे हैं, स्थिर समय-अंतराल छवि अधिग्रहण के लिए अनुमति देता है। उच्च गति के लिए एक विस्तृत गाइड, चार आयामी छवि अधिग्रहण भी कोंफोकल छवि के ढेर में गतिशील सूक्ष्मनलिकाएं के गुणों मात्र निर्धारण के लिए एक प्रोटोकॉल के रूप में, प्रदान की जाती है के रूप में अच्छी तरह से। इस विधि, पारंपरिक खमीर आनुवांशिकी के साथ संयुक्त, प्रांतएक दृष्टिकोण है कि विशिष्ट मात्रात्मक सूक्ष्मनलिका नियामकों या म्यूटेशन कि ट्यूबिलिन सब यूनिटों की गतिविधि में परिवर्तन के प्रभाव का आकलन करने के लिए अनुकूल है इडस।
Introduction
सूक्ष्मनलिकाएं cytoskeletal αβ ट्यूबिलिन प्रोटीन सब यूनिटों से बना पॉलिमर हैं और intracellular परिवहन, कोशिका विभाजन, morphogenesis, और गतिशीलता सहित सेलुलर संदर्भों की एक विस्तृत विविधता में इस्तेमाल कर रहे हैं। इन विविध भूमिकाओं के लिए सूक्ष्मनलिका नेटवर्क का निर्माण करने के लिए, कोशिकाओं ध्यान से विनियमित कब और कहाँ सूक्ष्मनलिकाएं प्रपत्र चाहिए। इस विनियमन प्रतिक्रियाओं को नियंत्रित करने से पूरा किया है कि या तो सूक्ष्मनलिका पॉलिमर या मुफ्त सब यूनिटों जुदा में सूक्ष्मनलिकाएं में αβ ट्यूबिलिन सब यूनिटों को इकट्ठा; इस सूक्ष्मनलिका गतिशीलता के रूप में जाना जाता है।
सूक्ष्मनलिका क्षेत्र का एक प्रमुख लक्ष्य आणविक तंत्र αβ ट्यूबिलिन सब यूनिटों और बाह्य नियामकों कि बाँध ट्यूबिलिन के लिए और / या सूक्ष्मनलिकाएं के अध्ययन सहित सूक्ष्मनलिका गतिशीलता, विनियमित स्पष्ट करना है। एक अच्छी तरह से स्थापित प्रयोगात्मक दृष्टिकोण कॉम में शुद्ध αβ ट्यूबिलिन प्रोटीन का उपयोग कर इन विट्रो में इस प्रणाली को पुनर्गठित करने, अक्सर हैशुद्ध बाह्य नियामकों के साथ bination। यद्यपि यह एक उपयोगी तरीका है, यह स्पष्ट है कि पुनर्गठन प्रणालियों में सूक्ष्मनलिका गतिशीलता जीवित कोशिकाओं में पाया कि से प्रभावशाली ढंग से अलग। उदाहरण के लिए, सूक्ष्मनलिकाएं तेजी से बढ़ने और इन विट्रो से विवो में धीमी हटना। इन मतभेदों को जाना जाता बाह्य नियामकों 1 की उपलब्धता है, साथ ही के लिए कोशिकाओं में अभी तक अपरिभाषित कारकों को जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। इसलिए, यह सूक्ष्मनलिका नियामकों और उत्परिवर्ती कि एक देशी सेलुलर संदर्भ में गतिशीलता को बाधित की गतिविधियों को निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है।
यद्यपि metazoan मॉडल सूक्ष्मनलिका समारोह और उच्च क्रम संगठन की जांच के लिए प्रचलित प्रणाली साबित हुए हैं, कई चिंताओं व्यावहारिक गंभीर रूप से सूक्ष्मनलिका गतिशीलता के सटीक माप के लिए इन मॉडलों की उपयोगिता की सीमा। सबसे पहले, सूक्ष्मनलिकाएं की उच्च संख्या, सेल प्रति हजारों दर्जनों से लेकर, आत्मविश्वास से करने के लिए यह कठिन बना देता हैसमय के साथ अलग-अलग सूक्ष्मनलिकाएं ट्रैक। कई अध्ययनों से पता इमेजिंग प्रोटीन है कि चुनिंदा ऐसे अंत बाध्यकारी (ईबी) परिवार में प्रोटीन के रूप में सूक्ष्मनलिका समाप्त होता है, करने के लिए स्थानीय बनाना द्वारा यह चुनौती का समाधान करें। हालांकि, इन प्रोटीनों केवल मेटाजोअन 2 में सूक्ष्मनलिकाएं बढ़ रहा के छोर तक स्थानीय बनाना जाना जाता है। इसलिए, इन प्रोटीन की उपयोगिता सीधे, विकास दर को मापने के लिए, जबकि केवल परोक्ष रूप से इस तरह के आपदा की आवृत्ति के रूप में गतिशीलता के अन्य पहलुओं को मापने के लिए सीमित है। दूसरा, जीनोम संपादन प्रौद्योगिकी में प्रगति के बावजूद कोशिकाओं स्थिरतापूर्वक fluorescently लेबल ट्यूबिलिन या म्यूटेशन चुनिंदा ट्यूबिलिन या सूक्ष्मनलिका नियामकों हेरफेर करने के लिए शुरू करने को व्यक्त कि बनाने एक महत्वपूर्ण चुनौती बनी हुई है। इसके अलावा, मेटाजोअन कई ट्यूबिलिन आइसोटाइप की उपस्थिति कैसे म्यूटेशन व्यक्ति ट्यूबिलिन जीन को प्रभावित के अध्ययन के घालमेल कर दिया है।
नवोदित खमीर प्रणाली विवो microtubu में मापने के लिए कई महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करता हैle गतिशीलता। खमीर एक सरलीकृत सूक्ष्मनलिका नेटवर्क है कि व्यक्ति सूक्ष्मनलिकाएं के दृश्य परमिट है। खमीर में, सूक्ष्मनलिकाएं धुरी पोल निकायों (SPBs) है, जो परमाणु लिफाफा 3 में एम्बेडेड रहे हैं के रूप में जाना केन्द्रों के आयोजन से निर्गत होना। SPBs γ ट्यूबिलिन छोटे परिसरों कि सूक्ष्मनलिकाएं 4, 5 नाभिक के लिए scaffolds के रूप में सेवा करते हैं। SPBs सूक्ष्मनलिकाएं, धुरी सूक्ष्मनलिकाएं और सूक्ष्म सूक्ष्मनलिकाएं के दो वर्गों नाभिक बनाना। Nucleoplasm में धुरी सूक्ष्मनलिकाएं परियोजना और kinetochore सूक्ष्मनलिकाएं के माध्यम से गुणसूत्रों के लिए संलग्न के लिए और interpolar सूक्ष्मनलिकाएं 6 ओवरलैपिंग के माध्यम से धुरी स्थिर लिए महत्वपूर्ण हैं। इसके विपरीत, बाहर की तरफ साइटोसोल में सूक्ष्म सूक्ष्मनलिकाएं परियोजना और धुरी सूक्ष्मनलिकाएं के घने नेटवर्क की तुलना में अपेक्षाकृत दुर्लभ रहे हैं। समसूत्री विभाजन के दौरान, पूर्व पश्चावस्था कोशिकाओं केवल 1-2 सूक्ष्म या तो SPB से निकलती सूक्ष्मनलिकाएं है; इन मैं के रूप में मौजूदबल्कि बंडल के रूप में 7 से ndividual सूक्ष्मनलिकाएं। समसूत्री विभाजन के दौरान सूक्ष्म सूक्ष्मनलिकाएं की भूमिका मां और कली डिब्बों, कली से गर्दन के रूप में जाना के बीच के जंक्शन में नाभिक और धुरी स्थानांतरित करने के लिए है। इस आंदोलन को अच्छी तरह से परिभाषित मार्ग है कि सूक्ष्म सूक्ष्मनलिकाएं पर बल उत्पन्न, की ओर और कली गर्दन 8 में अंत में नाभिक और धुरी खींच शामिल है।
खमीर प्रणाली का एक और लाभ अपने आनुवंशिकी, जो अद्वितीय परिशुद्धता के साथ सूक्ष्मनलिका नियामकों और ट्यूबिलिन सब यूनिटों की जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता की उपयोगिता है। एक भी β ट्यूबिलिन जीन (TUB2 हैं) और दो α ट्यूबिलिन जीन (TUB1 और TUB3): खमीर भी ट्यूबिलिन आइसोटाइप के एक सरलीकृत प्रदर्शनों की सूची होती है। उत्परिवर्तन आसानी से इन जीनों में पेश किया जा सकता है और इस तरह एक समरूप ट्यूबिलिन जनसंख्या 9, 10 में अध्ययन किया। व्यापक रूप से की एक संख्या हैंलेबलिंग सूक्ष्मनलिकाएं के लिए उपलब्ध निर्माणों, और इन स्थिर अभिव्यक्ति के लिए गुणसूत्र loci पर एकीकरण के लिए लक्षित किया जा सकता (चर्चा देखें)।
इस विधि का समग्र लक्ष्य सूक्ष्मनलिका गतिशीलता के उच्च संकल्प माप के लिए चार आयाम (एक्स, वाई, जेड, और टी) में खमीर कोशिकाओं में रहने वाले छवि एकल सूक्ष्मनलिकाएं है। संघटित, निम्न स्तर के खमीर कोशिकाओं में fluorescently लेबल ट्यूबिलिन की अभिव्यक्ति के लिए निर्माणों एकीकृत करने के लिए तरीके से वर्णित हैं। इमेजिंग करने से पहले, जीवित कोशिकाओं लंबे समय तक इमेजिंग के लिए कोशिकाओं को स्थिर करने के लेक्टिन Concanavalin एक साथ लेपित स्लाइड कक्षों में रखा जाता है। छवि अधिग्रहण के लिए इष्टतम मानकों, साथ ही डेटा विश्लेषण करने के लिए एक कार्यप्रवाह, यह भी बताया गया है।
Protocol
Representative Results
Discussion
नवोदित खमीर मॉडल एक इन विवो में स्थापित करने में सूक्ष्मनलिका गतिशीलता के उच्च संकल्प माप एकत्र करने, समय के साथ छवि एकल सूक्ष्मनलिकाएं करने की क्षमता और tubulins और सूक्ष्मनलिका नियामकों खमीर आनुवंशि…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम विभिन्न एफपी-TUB1 प्लास्मिड साझा करने के लिए केरी ब्लूम (उत्तरी कैरोलिना विश्वविद्यालय), क्यूंग ली (NCI), स्टीवन मार्कस (कोलोराडो राज्य विश्वविद्यालय), और इल्मार शीबल (यूनिवर्सिटैट हीडलबर्ग) धन्यवाद। हम स्लाइड चैम्बर तैयारी विधि में प्रशिक्षण के लिए मेलिस्सा गार्डनर (मिनेसोटा विश्वविद्यालय) के आभारी हैं। यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) R01GM112893-01A1 (JKM के लिए) और T32GM008730 (ईस्वी) देने का समर्थन मिला।
Materials
| DOB (dropout bases) | Sunrise science | 1650 | |
| CSM-Leu | Sunrise science | 1005 | |
| Agar | Ameresco | N833 | |
| 100mm polystyrene plates | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| ssDNA (Samon Sperm) in sterile DiH2O | Sigma-Aldrich | D7656 | resuspend at 10 mg/mL in DiH2O. Store aliquots at -20 ºC |
| Synthetic Complete Media | Sunrise science | 1459-100 | |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | L7647 | resuspend at 2 mg/mL in DiH2O. Store aliquots at -20 ºC |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| Microscope Coverslips | Fisher Scientific | 12-541-B | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | paraffin film |
| VALAP (Equal parts of Vaseline, lanolin and paraffin) | melt at 75 ºC before use | ||
| forceps | Fisher Scientific | 16-100-106 | |
| Poyethylene glycol (PEG) 3350 | Sigma-Aldrich | 202444 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | |||
| Ti E inverted Perfect Focus microscope | Nikon Instruments | MEA53100 | |
| 1.45 NA 100x CFI Plan Apo objective | Nikon Instruments | MRD01905 | |
| Piezo electric stage | Physik Instrumente | P-736 | |
| Spinning disk scanner | Yokogawa | CSU10 | |
| Laser combiner module | Agilent Technologies | MCL400B | |
| EMCCD camera | Andor Technology | iXon Ultra 897 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| NIS Elements software | Nikon Instruments | MQS31100 | |
| Microsoft Excel software | Microsoft | ||
| MATLAB software | MathWorks, Inc | ||
| ImageJ64 | NIH | Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. | |
| Bio-Formats Importer plug-in | Open Microscopy Environment | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids | |||
| pUC19-LEU2::GFP-TUB1 | pSK1050 | reference: Song, S. and Lee, K. S. A novel function of Saccharomyces cerevisiae CDC5 in cytokinesis. J Cell Biol. 152 (3), 451-469 (2001) |
Referências
- Zanic, M., Widlund, P. O., Hyman, A. A., Howard, J. Synergy between XMAP215 and EB1 increases microtubule growth rates to physiological levels. Nat Cell Biol. 15 (6), 688-693 (2013).
- Mimori-Kiyosue, Y., Shiina, N., Tsukita, S. The dynamic behavior of the APC-binding protein EB1 on the distal ends of microtubules. Curr Biol. 10 (14), 865-868 (2000).
- Byers, B., Goetsch, L. Behavior of spindles and spindle plaques in the cell cycle and conjugation of Saccharomyces cerevisiae. J Bacteriol. 124 (1), 511-523 (1975).
- Marschall, L. G., Jeng, R. L., Mulholland, J., Stearns, T. Analysis of Tub4p, a yeast gamma-tubulin-like protein: implications for microtubule-organizing center function. J Cell Biol. 134 (2), 443-454 (1996).
- Spang, A., Geissler, S., Grein, K., Schiebel, E. gamma-Tubulin-like Tub4p of Saccharomyces cerevisiae is associated with the spindle pole body substructures that organize microtubules and is required for mitotic spindle formation. J Cell Biol. 134 (2), 429-441 (1996).
- Winey, M., Bloom, K. Mitotic spindle form and function. Genética. 190 (4), 1197-1224 (2012).
- Gupta, M. L. J., et al. beta-Tubulin C354 mutations that severely decrease microtubule dynamics do not prevent nuclear migration in yeast. Mol Biol Cell. 13 (8), 2919-2932 (2002).
- Moore, J. K., Cooper, J. A. Coordinating mitosis with cell polarity: Molecular motors at the cell cortex. Semin Cell Dev Biol. 21 (3), 283-289 (2010).
- Gartz Hanson, M., et al. Novel alpha-tubulin mutation disrupts neural development and tubulin proteostasis. Dev Biol. 409 (2), 406-419 (2016).
- Fees, C. P., Aiken, J., O’Toole, E. T., Giddings, T. H. J., Moore, J. K. The negatively charged carboxy-terminal tail of beta-tubulin promotes proper chromosome segregation. Mol Biol Cell. 27 (11), 1786-1796 (2016).
- Song, S., Lee, K. S. A novel function of Saccharomyces cerevisiae CDC5 in cytokinesis. J Cell Biol. 152 (3), 451-469 (2001).
- Knop, M., et al. Epitope tagging of yeast genes using a PCR-based strategy: more tags and improved practical routines. Yeast. 15 (10B), 963-972 (1999).
- Kosco, K. A., et al. Control of microtubule dynamics by Stu2p is essential for spindle orientation and metaphase chromosome alignment in yeast. Mol Biol Cell. 12 (9), 2870-2880 (2001).
- Toso, R. J., Jordan, M. A., Farrell, K. W., Matsumoto, B., Wilson, L. Kinetic stabilization of microtubule dynamic instability in vitro by vinblastine. Bioquímica. 32 (5), 1285-1293 (1993).
- Aiken, J., Sept, D., Costanzo, M., Boone, C., Cooper, J. A., Moore, J. K. Genome-wide analysis reveals novel and discrete functions for tubulin carboxy-terminal tails. Curr Biol. 24 (12), 1295-1303 (2014).
- Straight, A. F., Marshall, W. F., Sedat, J. W., Murray, A. W. Mitosis in living budding yeast: anaphase A but no metaphase plate. Science. 277 (5325), 574-578 (1997).
- Khmelinskii, A., Lawrence, C., Roostalu, J., Schiebel, E. Cdc14-regulated midzone assembly controls anaphase B. J Cell Biol. 177 (6), 981-993 (2007).
- Markus, S. M., Omer, S., Baranowski, K., Lee, W. L. Improved Plasmids for Fluorescent Protein Tagging of Microtubules in Saccharomyces cerevisiae. Traffic. 16 (7), 773-786 (2015).
