Whole-cell opnames van Drosophila melanogaster fotoreceptoren maken het mogelijk om spontaan donkere stoten, kwantumstoten, macroscopische reacties op licht en spanningsrelaties onder verschillende omstandigheden te meten. In combinatie met D. melanogaster genetische manipulatie instrumenten, deze methode maakt het mogelijk om de alomtegenwoordige inositol-lipide signalering weg en zijn doel, het TRP kanaal te onderzoeken.
Whole-cell voltage voltage opnames van Drosophila melanogaster photoreceptors hebben het gebied van de invertebrate visuele transductie, waardoor het gebruik van D. melanogaster moleculaire genetica inositol-lipid signalering en transient receptor receptor potentiële (TRP) kanalen op het single-molecuul niveau kunnen onderzoeken. Een handvol labs hebben deze krachtige techniek beheerd, waardoor de fysiologische responsen op licht onder zeer gecontroleerde omstandigheden kunnen worden geanalyseerd. Deze techniek zorgt voor controle over de intracellulaire en extracellulaire media; De membraanspanning; En de snelle toepassing van farmacologische verbindingen, zoals een verscheidenheid aan ionische of pH-indicatoren, op de intra- en extracellulaire media. Met een uitzonderlijk hoge signaal-ruisverhouding kan deze methode de meting van donkere spontane en licht geïnduceerde eenheidstromen ( dwz spontane en kwantumstoten) en macroscopische licht-geïnduceerde stromingen (LIC) van de zondeGle D. melanogaster fotoreceptoren. Dit protocol schetst in groot detail alle belangrijke stappen die nodig zijn om deze techniek uit te voeren, die zowel elektrofysiologische als optische opnamen omvat. De procedure voor de retina dissectie voor het bereiken van intacte en levensvatbare ex vivo geïsoleerde ommatidia in de badkamer wordt beschreven. De apparatuur die nodig is voor het uitvoeren van full-cell en fluorescentie beeldvorming metingen zijn ook gedetailleerd. Tenslotte worden de valkuilen in het gebruik van deze delicate voorbereiding tijdens uitgebreide experimenten toegelicht.
Uitgebreide genetische studies van de vruchtvlieg , Drosophila melanogaster ( D. melanogaster) , die meer dan 100 jaar geleden zijn ingezet, hebben de D. melanogastervliegtuig opgezet als een extreem nuttig experimenteel model voor de genetische dissectie van complexe biologische processen. De hierna beschreven methodologie combineert de geaccumuleerde kracht van de D. melanogaster moleculaire genetica met de hoge signaal- ruisverhouding van volledige-cel patch klemopnamen. Deze combinatie zorgt voor de studie van D. melanogaster phototransduction als een model van inositol-lipid signalering en TRP kanaal regulatie en activatie, zowel in de native omgeving als bij de hoogste resolutie van enkele moleculen.
Toepassing van de hele cel opname methode op D. melanogaster photoreceptors heeft de studie van invertebrate phototransduction omgezet. Deze methode is ontwikkeld door Hardie 1 en indepEindelijk door Ranganathan en collega's 2 ~ 26 jaar geleden en was ontworpen om de uitgebreide genetische manipulatie-instrumenten van D. melanogaster te exploiteren en ze te gebruiken om mechanismen van fototransductie en inositol-lipide signalering te ontdekken. In de eerste plaats leed deze techniek aan een snelle vermindering van de lichtgevoeligheid en een lage opbrengst van ommatidia tijdens het dissectieproces, waardoor gedetailleerde kwantitatieve studies werden voorkomen. Later verhoogde de toevoeging van ATP en NAD aan de patchpipet de geschiktheid van het preparaat voor langdurige kwantitatieve opnames. Vervolgens werd uitgebreide karakterisering van het signaal-transductiemchanisme op het moleculaire niveau gerealiseerd.
Momenteel is D. melanogaster phototransduction één van de weinige systemen waarin fosfoinositide-signalering en TRP kanalen ex vivo kunnen worden bestudeerd bij een molecuulresolutie. Dit maakt D. melanogaster phototransduction en de mijThodology ontwikkeld om dit mechanisme een zeer gevoelig modelsysteem te bestuderen. Dit protocol beschrijft hoe het D. melanogaster retina dissecteert en de geïsoleerde ommatidia van de omliggende pigment (glia) cellen mechanisch afbreken. Dit stelt de vorming van een giga-seal en een hele-cel patch klem op de photoreceptor cel lichamen mogelijk. Gelukkig zijn de meeste signaalproteïnen beperkt tot de rhabdomere en diffunderen ze niet. Bovendien is er een immobiele Ca 2+ buffer genaamd calphotin, gelegen tussen het signaalcompartiment en het cellichaam 3 , 4 en een hoog expressieniveau van de Na + / Ca 2+ wisselaar (CalX) in de microvilli 5 . Samen vormen de eiwitbevestiging aan de rhabdomere, de calphotinbuffer en de hoge expressie van de CalX relatief langdurige ( dwz maximaal ~ 20 minuten) volledige celopnamen zonder verlies van essentiële componentenVan het fototransductieproces en met behoud van hoge gevoeligheid voor licht. Het volgende protocol beschrijft hoe u geïsoleerde ommatidia kunt verkrijgen en volledige cilinderopnamen uitvoeren die de inheemse eigenschappen van de fototransductiekascade voorkomen. Hele-cel patch klem experimenten op gedissocieerde kakkerlak ( Periplaneta americana ) 6 en cricket ( Gryllus bimaculatus ) 7 ommatidia werden op dezelfde wijze uitgevoerd als die beschreven voor D. melanogaster . Daarnaast werden patchclamp-experimenten op gedissocieerde fotoreceptoren van het bestandsbloem, ( Lima scabra ) en sint- jakobsschelp ( Pecten-irradians ) op een enigszins andere manier uitgevoerd dan die uitgevoerd op D. melanogaster , waardoor zowel de hele cel 8 als een kanaalsmeting 9 . Hier worden de belangrijkste prestaties verkregen in D. melanogaster met behulp van deze techniek beschreven. De discussie iBevat de beschrijving van sommige valkuilen en beperkingen van deze techniek.
De toepassing van hele cel opnames op D. melanogaster fotoreceptoren toegestaan voor de ontdekking en de functionele toelichting van nieuwe signalering eiwitten, zoals TRP kanalen 27 , 28 , 29 en INAD 30 , 31 , 32 steiger eiwit. Sinds de initiële introductie van deze techniek heeft het de oplossing van langetermijnvraagstukken over het ionische mechanisme en spanningsafhankelijkheid van het lichtrespons mogelijk gemaakt. Dit gebeurde door het toegewezen vermogen om de membraanspanning en extracellulaire en intracellulaire ionische samenstelling 19 , 28 nauwkeurig te regelen.
Een belangrijk obstakel van de patch klemmethode in D. melanogaster is de fragiliteit van de geïsoleerde ommatidia preparantsoen. Uitgebreide studies hebben aangetoond dat de integriteit van de phototransductiemachines kritisch hangt af van de doorlopende levering van ATP, vooral bij lichtbelichting, wat leidt tot een groot verbruik van ATP. Helaas elimineert de mechanische striping van de pigmenten ( dwz glia) cellen, die nodig zijn om het fotoreceptormembraan met de patchpipet te bereiken, de belangrijkste bron van metabolieten die nodig zijn voor ATP-productie 33 . Toepassing van exogene ATP in de opnamepipet voldoet slechts gedeeltelijk aan de eis voor grote hoeveelheden ATP. Een tekort aan ATP leidt tot spontane activering van de TRP kanalen en naar de dissociatie van de phototransduction machines van de licht geactiveerde kanalen, waardoor een grote toename van cellulaire Ca 2+ en de afschaffing van de normale respons op licht 34 , 35 wordt veroorzaakt. Deze reeks gebeurtenissen is niet te wijten aan schade aan deFotoreceptoren door de dissectieprocedure, maar liever naar de cellulaire depletie van ATP. Om te voorkomen dat deze volgorde van gebeurtenissen optreedt en om normale lichteffecten te handhaven, mogen de fotoreceptoren niet worden blootgesteld aan intense lichten, die grote hoeveelheden ATP verbruiken. Ook moet NAD in de opnamepipet opgenomen worden, vermoedelijk om ATP-productie in de mitochondria 18 , 36 te vergemakkelijken. Voor de metingen van spontane en kwantumstoten is de bovengenoemde moeilijkheid minimaal omdat alleen dimlichten worden gebruikt. In de praktijk kan een stabiele hele-cel opname worden gehandhaafd voor ~ 20-25 minuten, hoewel er een tendens is voor reactiekinetiek om gedurende deze periode te vertragen. Een enkele bereiding van gedisocieerd ommatidia kan tot 2 uur levensvatbaar blijven.
Een bijkomende tekortkoming van de geïsoleerde ommatidiapreparatie is de ontoegankelijkheid van de microvilli, die vertaalt naar de ontoegankelijkheid van de TRP enTRPL kanalen naar de opnamepipet, waardoor opnamen met een kanaal worden voorkomen. Met behulp van een methode die ze ontwikkelden, slaagde Bacigalupo en collega's erin om directe opnamen uit de rhabdomere 37 direct op te nemen . Deze kanaalactiviteit verschilt echter van die van TRPL kanalen die heterologisch tot expressie komen in weefselkweekcellen 38 en van TRP-kanaalactiviteit afgeleid van schotgeluidsanalyse verkregen uit geïsoleerde ommatidia 34 . Vermoedelijk beschadigde de dissectieprocedure de fotoreceptorcellen bij het gebruik van deze methode.
The authors have nothing to disclose.
Het experimentele deel van dit onderzoek werd ondersteund door subsidies van de VS-Israël Bi National Science Foundation (BM en IL), de Israëlische Science Foundation (ISF), de Deutsch-Israëlische Projektkooperatie (DIP) (naar BM) en de Biotechnologie En Onderzoeksraad Biologische Wetenschappen (BBSRC Grant-nummers: BB / M007006 / 1 en BB / D007585 / 1) naar RCH
10 ml syringe | |||
5 ml syringe | |||
1 ml syringe with elongated tip | |||
Petri dish | 60 mm | ||
Silicone dissection dish/block | Dow Corning | Sylguard 184 Silicone Elastomer Kit | Throughly mix both components, pour into mould and cure for 2 hours at 60ᵒC |
Syringe filters | Millex | 22 µm PVDF filter | |
Capillaries (for omatidia separation) | Glass, 1.2 x 0.68 mm (~7.5 cm each) | ||
Polyethylene Tubing | Becton Dickinson | 1.57 x 1.14 mm (35 cm) | |
2 small beakers | 50 ml or less | ||
2 paraffin film sheets | Parafilm M | ~5 x 5 cm | |
Bath chamber | home made | ||
Cover slips | 22 x 22 mm No. 0 | ||
Paraplast Plus | Sigma | Paraffin – polyisobutylene mixture | To glue the coverslip onto the bottom of the bath chamber |
Ground | Warner Instruments | 64-1288 | Hybrid Assembly Ag-AgCl Wire Assembly |
Headless micro dissection needle | Entomology, 12 mm | ||
Micro dissecting needle holder | |||
Vise | |||
2 fine tweezers + 1 rough tweezers | Dumont #5, Biology | 0.05 x 0.02 mm, length 110 mm, Inox | |
Stereoscopic zoom Microscope | Nikon | SMZ-2B | |
Cold light source | Schott | KL1500 LCD | |
Filter (Color) for cold light source | Schott | RG620 | |
Delicate wipers | Kimtech | Kimwipes | |
Electrode holder | Warner Instruments | QSW-T10P | Q series Holders compatible with Axon amplifiers, straight body style |
Silver Wire | Warner Instruments | 0.25 mm diameter, needs to be chloridized | |
Micromanipulator | Sutter Instruments | MP 85 | Huxley-Wall Style Micromanipulator |
Faraday cage | home made | Electromagnetic noise shielding and black front curtain | |
Anti-vibration Table | Newport | VW-3036-OPT-01 | |
Osilloscope | GW | GOS-622G | |
Perfusion system | Warner Instruments | VC-8P | Pinch valve control system |
Perfusion valve controller | Scientific instruments | BPS-8 | |
Suction system | |||
Amplifier | Molecular Device | Axopatch-1D | |
Head-stage | Molecular Device | CV – 4 | Gain: x 1/100 |
A/D converter | Molecular Device | Digidata 1440A | |
Clampex | Molecular Device | 10 | software |
pCLAMP | Molecular Device | 10 | software |
Light source (Xenon Arc lamp) | Sutter Instruments | Lambda LS | |
Light detector | home made | phototransistor | |
Filter wheel and shutter controller | Sutter Instruments | Lambda 10-2 with a Uniblitz shutter | |
Filters (Natural density filter) | Chroma | 6,5,4,3,2,1,0.5,0.3 | |
Filter (Color) | Schott | OG590, Edge filter | |
Xenon Flash Lamp system | Dr. Rapp OptoElecftronic | JML-C2 | |
Light guide | Quartz | ||
Pulse generator | AMPI | Master 8 | |
Microscope | Olympus | IX71, Inverted | |
Red illumination filter (Microscope) | RG630 / RG645 ø45mm | ||
Microscope objective | Olympus | X60/0.9 UplanFL N air or X60/1.25 UplanFI oil | |
CCD Camera | Andor | iXon DU885K | |
NIS Element | Nikon | AR | software |
Ca+2 indicator | Invitrogen | Calcium green 5N | |
Excitation & emission filters and dichroic mirror | Chroma | 19002 – AT – GFP/FITC Longpass set | |
Vertical pipette puller | Narishige | Model PP83 | Use either vertical or horizontal puller, as preferred. |
Horizontal pipette puller | Sutter Instrument | Model P-1000 Flaming/Brown Micropipette Puller | |
Filament | Sutter Instrument | 3 mm trough or square box | |
Capillaries | Harvard Apparatus | borosilicate glass capillaries | 1 x 0.58 mm |