Las grabaciones de células enteras de los fotorreceptores de Drosophila melanogaster permiten medir las colisiones oscuras espontáneas, los baches cuánticos, las respuestas macroscópicas a la luz y las relaciones tensión-corriente bajo diversas condiciones. En combinación con las herramientas de manipulación genética de D. melanogaster , este método permite el estudio de la vía omnipresente de señalización de los inositol-lípidos y su objetivo, el canal TRP.
Las grabaciones de tensión de células enteras de los fotorreceptores de Drosophila melanogaster han revolucionado el campo de la transducción visual de invertebrados, permitiendo el uso de la genética molecular de D. melanogaster para estudiar los canales de señalización de inositol-lípidos y Potencial de Receptor Transitorio (TRP) al nivel de una sola molécula. Un puñado de laboratorios han dominado esta poderosa técnica, que permite el análisis de las respuestas fisiológicas a la luz bajo condiciones altamente controladas. Esta técnica permite el control sobre los medios intracelulares y extracelulares; La tensión de la membrana; Y la rápida aplicación de compuestos farmacológicos, tales como una variedad de indicadores iónicos o de pH, a los medios intracelulares y extracelulares. Con una relación señal / ruido excepcionalmente alta, este método permite medir las corrientes unitarias oscuras espontáneas y inducidas por la luz ( es decir, espontáneas y cuánticas) y las corrientes inducidas por la luz (LIC) macroscópicas del sinGle D. melanogaster fotorreceptores. Este protocolo describe, con gran detalle, todos los pasos clave necesarios para llevar a cabo esta técnica, que incluye grabaciones electrofisiológicas y ópticas. Se describe el procedimiento de disección de retina de la mosca para el logro de ommatidia aislada ex vivo intacta y viable en la cámara de baño. También se detallan los equipos necesarios para realizar mediciones de células enteras y de fluorescencia. Finalmente, se explican las dificultades en el uso de esta delicada preparación durante experimentos prolongados.
Los extensos estudios genéticos de la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster ( D. melanogaster) , iniciada hace más de 100 años, han establecido la mosca de D. melanogaster como un modelo experimental extremadamente útil para la disección genética de procesos biológicos complejos. La metodología descrita a continuación combina el poder acumulado de la genética molecular de D. melanogaster con la alta relación señal / ruido de las grabaciones de parches de parche de células enteras. Esta combinación permite estudiar la fototransducción de D. melanogaster como modelo de señalización de inositol-lípidos y regulación y activación de canales de TRP, tanto en el medio nativo como en la mayor resolución de moléculas individuales.
La aplicación del método de registro de células enteras a los fotorreceptores de D. melanogaster ha revolucionado el estudio de la fototransducción de invertebrados. Este método fue desarrollado por Hardie 1 e indepPor Ranganathan y colegas hace 2 ~ 26 años y fue diseñado para explotar las herramientas de manipulación genética extensa de D. melanogaster y utilizarlos para descubrir los mecanismos de la fototransducción y la señalización de inositol-lípidos. Al principio, esta técnica sufría una rápida reducción de la sensibilidad a la luz y un bajo rendimiento de ommatidia durante el proceso de disección, lo que impidió realizar estudios cuantitativos detallados. Más tarde, la adición de ATP y NAD a la pipeta de parche aumentó dramáticamente la idoneidad de la preparación para grabaciones cuantitativas prolongadas. Posteriormente, se realizó una caracterización extensiva del mecanismo de transducción de señal a nivel molecular.
Actualmente, la fototransducción de D. melanogaster es uno de los pocos sistemas en los que la señalización de fosfoinositidos y los canales de TRP pueden estudiarse ex vivo en resolución de molécula única. Esto hace que la fototransducción de D. melanogaster y el yoThodology desarrollado para estudiar este mecanismo un sistema modelo altamente sensible. Este protocolo describe cómo disecar la retina de D. melanogaster y separar mecánicamente la ommatidia aislada de las células del pigmento circundante (glia). Esto permite la formación de un giga-sello y una abrazadera de parche de células enteras en los cuerpos de las células fotorreceptoras. Afortunadamente, la mayoría de las proteínas de señalización están confinadas al rhabdomere y no difunden. Además, hay un buffer de Ca 2+ inmóvil llamado calphotin, localizado entre el compartimiento que señala y el cuerpo celular 3 , 4 , y un nivel alto de la expresión del intercambiador de Na + / Ca 2+ (CalX) en el microvilli. En conjunto, el confinamiento de proteínas al rhabdomere, el tampón de calphotin y la alta expresión del CalX permiten registros de células enteras relativamente prolongados ( es decir, hasta 20 minutos), sin la pérdida de componentes esencialesDel proceso de fototransducción y manteniendo al mismo tiempo una alta sensibilidad a la luz. El siguiente protocolo describe cómo obtener ommatidia aislada y realizar grabaciones de células enteras que parecen preservar las propiedades nativas de la cascada de fototransducción. Se realizaron experimentos de parches de parche de células enteras en cucaracha disociada ( Periplaneta americana ) 6 y grillo ( Gryllus bimaculatus ) 7 ommatidia de manera similar a la descrita para D. melanogaster . Además, se realizaron experimentos de fijación de parche en fotorreceptores disociados del almeja de archivo ( Lima scabra ) y vieira ( Pecten irradians ) de una manera ligeramente diferente a la realizada en D. melanogaster , permitiendo tanto mediciones de células enteras 8 como monocanales 9 . Aquí se describen los principales logros obtenidos en D. melanogaster utilizando esta técnica. La discusión iIncluye la descripción de algunos escollos y limitaciones de esta técnica.
La aplicación de grabaciones de células enteras a los fotorreceptores de D. melanogaster permitió el descubrimiento y la elucidación funcional de nuevas proteínas de señalización, como los canales TRP 27 , 28 , 29 e INAD 30 , 31 , 32 de la proteína andamiaje. Desde la introducción inicial de esta técnica, permitió la resolución de preguntas básicas a largo plazo sobre el mecanismo iónico y la dependencia de voltaje de la respuesta de luz. Esto ocurrió debido a la capacidad conferida de controlar con precisión el voltaje de la membrana y la composición iónica extracelular e intracelular 19 , 28 .
Un obstáculo importante de la técnica de pinzamiento de remiendo en D. melanogaster ha sido la fragilidad de la aislada prema de ommatidiaracionar. Estudios detallados han revelado que la integridad de la maquinaria de fototransducción depende críticamente del suministro continuo de ATP, especialmente durante la exposición a la luz, lo que conduce a un gran consumo de ATP. Por desgracia, el rayado mecánico de las células de pigmento ( es decir, glia), que se requiere para alcanzar la membrana fotorreceptor con la pipeta patch, elimina la principal fuente de metabolitos necesarios para la producción de ATP [ 33] . La aplicación de ATP exógeno en la pipeta de registro sólo cumple parcialmente el requisito de grandes cantidades de ATP. Un corto suministro de ATP conduce a la activación espontánea de los canales TRP ya la disociación de la maquinaria de fototransducción de los canales activados por luz, causando un gran aumento de Ca 2 + celular y la abolición de la respuesta normal a la luz 34 , 35 . Esta secuencia de eventos no se debe al daño de laFotorreceptores por el procedimiento de disección, sino más bien al agotamiento celular de ATP. Para evitar que se produzca esta secuencia de eventos y para mantener las respuestas de luz normales, los fotorreceptores no deben ser expuestos a luces intensas, que consumen grandes cantidades de ATP. Además, NAD debe ser incluido en la pipeta de grabación, presumiblemente para facilitar la producción de ATP en las mitocondrias [ 18 , 36] . Para las mediciones de los baches espontáneos y cuánticos, la dificultad anterior es mínima porque sólo se utilizan luces débiles. En la práctica, se puede mantener una grabación estable de células enteras durante ~ 20-25 min, aunque existe una tendencia a que la cinética de respuesta se ralentice durante este periodo. Una sola preparación de ommatidia disociada puede permanecer viable hasta 2 h.
Una deficiencia adicional de la preparación de ommatidia aislada es la inaccesibilidad de los microvellosidades, lo que se traduce en la inaccesibilidad del TRP yTRPL a la pipeta de grabación, evitando las grabaciones de un solo canal. Utilizando un método que desarrollaron, Bacigalupo y sus colegas lograron registrar directamente la actividad de un solo canal del rhabdomere 37 . Sin embargo, esta actividad de canal difiere de la de los canales TRPL heterólogamente expresado en células de cultivo de tejidos [ 38] y de la actividad del canal TRP derivados de análisis de ruido de disparo obtenido de ommatidia aislados [ 34] . Presumiblemente, el procedimiento de disección dañó en gran medida las células fotorreceptoras cuando se usa este método.
The authors have nothing to disclose.
La parte experimental de esta investigación fue apoyada por donaciones de la Fundación Nacional de Ciencias Bi-Israel (a BM e IL), la Fundación de Ciencia de Israel (ISF), la Deutsch-Israelische Projektkooperation (DIP) (a BM) y la Biotechnology Y el Consejo de Investigación en Ciencias Biológicas (BBSRC Grant números: BB / M007006 / 1 y BB / D007585 / 1) a RCH
10 ml syringe | |||
5 ml syringe | |||
1 ml syringe with elongated tip | |||
Petri dish | 60 mm | ||
Silicone dissection dish/block | Dow Corning | Sylguard 184 Silicone Elastomer Kit | Throughly mix both components, pour into mould and cure for 2 hours at 60ᵒC |
Syringe filters | Millex | 22 µm PVDF filter | |
Capillaries (for omatidia separation) | Glass, 1.2 x 0.68 mm (~7.5 cm each) | ||
Polyethylene Tubing | Becton Dickinson | 1.57 x 1.14 mm (35 cm) | |
2 small beakers | 50 ml or less | ||
2 paraffin film sheets | Parafilm M | ~5 x 5 cm | |
Bath chamber | home made | ||
Cover slips | 22 x 22 mm No. 0 | ||
Paraplast Plus | Sigma | Paraffin – polyisobutylene mixture | To glue the coverslip onto the bottom of the bath chamber |
Ground | Warner Instruments | 64-1288 | Hybrid Assembly Ag-AgCl Wire Assembly |
Headless micro dissection needle | Entomology, 12 mm | ||
Micro dissecting needle holder | |||
Vise | |||
2 fine tweezers + 1 rough tweezers | Dumont #5, Biology | 0.05 x 0.02 mm, length 110 mm, Inox | |
Stereoscopic zoom Microscope | Nikon | SMZ-2B | |
Cold light source | Schott | KL1500 LCD | |
Filter (Color) for cold light source | Schott | RG620 | |
Delicate wipers | Kimtech | Kimwipes | |
Electrode holder | Warner Instruments | QSW-T10P | Q series Holders compatible with Axon amplifiers, straight body style |
Silver Wire | Warner Instruments | 0.25 mm diameter, needs to be chloridized | |
Micromanipulator | Sutter Instruments | MP 85 | Huxley-Wall Style Micromanipulator |
Faraday cage | home made | Electromagnetic noise shielding and black front curtain | |
Anti-vibration Table | Newport | VW-3036-OPT-01 | |
Osilloscope | GW | GOS-622G | |
Perfusion system | Warner Instruments | VC-8P | Pinch valve control system |
Perfusion valve controller | Scientific instruments | BPS-8 | |
Suction system | |||
Amplifier | Molecular Device | Axopatch-1D | |
Head-stage | Molecular Device | CV – 4 | Gain: x 1/100 |
A/D converter | Molecular Device | Digidata 1440A | |
Clampex | Molecular Device | 10 | software |
pCLAMP | Molecular Device | 10 | software |
Light source (Xenon Arc lamp) | Sutter Instruments | Lambda LS | |
Light detector | home made | phototransistor | |
Filter wheel and shutter controller | Sutter Instruments | Lambda 10-2 with a Uniblitz shutter | |
Filters (Natural density filter) | Chroma | 6,5,4,3,2,1,0.5,0.3 | |
Filter (Color) | Schott | OG590, Edge filter | |
Xenon Flash Lamp system | Dr. Rapp OptoElecftronic | JML-C2 | |
Light guide | Quartz | ||
Pulse generator | AMPI | Master 8 | |
Microscope | Olympus | IX71, Inverted | |
Red illumination filter (Microscope) | RG630 / RG645 ø45mm | ||
Microscope objective | Olympus | X60/0.9 UplanFL N air or X60/1.25 UplanFI oil | |
CCD Camera | Andor | iXon DU885K | |
NIS Element | Nikon | AR | software |
Ca+2 indicator | Invitrogen | Calcium green 5N | |
Excitation & emission filters and dichroic mirror | Chroma | 19002 – AT – GFP/FITC Longpass set | |
Vertical pipette puller | Narishige | Model PP83 | Use either vertical or horizontal puller, as preferred. |
Horizontal pipette puller | Sutter Instrument | Model P-1000 Flaming/Brown Micropipette Puller | |
Filament | Sutter Instrument | 3 mm trough or square box | |
Capillaries | Harvard Apparatus | borosilicate glass capillaries | 1 x 0.58 mm |