의 배아 혈관 신생에 대한 시각화 및 정량 분석<em> Xenopus tropicalis</em
Summary
이 프로토콜은 vasculature를 시각화하고 Xenopus tropicalis 의 복잡성을 정량화하기위한 형광 기반의 방법을 보여 줍니다 . 혈관은 생체 내에서 심혈관 질환 발달을 연구하기 위해 유전 적 및 / 또는 약리학 적 조작 후 배아의 박동 심장에 형광 염료를 주입 한 후 수분 내에 영상화 될 수있다.
Abstract
혈관은 몸 전체에 산소와 영양분을 공급하며 혈관 네트워크의 형성은 엄격한 발달 조절하에 있습니다. 혈관의 효율적인 생체 내 시각화 및 그 복잡성의 신뢰할 수있는 정량화는 혈관 네트워크의 생물학 및 질병을 이해하는 데 중요합니다. 여기서는 상업적으로 이용 가능한 형광 염료 인 인간 혈장 아세틸 화 저밀도 지단백 DiI 복합체 (DiI-AcLDL)를 사용하여 혈관을 시각화하고 Xenopus tropicalis 의 복잡성을 정량화하는 자세한 방법을 제공합니다. 혈관은 DiI-AcLDL을 배아의 심장 박동에 간단히 주입하여 표시 할 수 있으며 전체 배아의 혈관을 생체 또는 고정 배아에서 영상화 할 수 있습니다. 핵산의 표적 미세 주입 및 / 또는 약리학 적 시약의 배양 적용에 의한 유전자 교란과 결합하여, 혈관 발생에 대한 유전자 또는 신호 전달 경로의 역할을 수행 할 수있다정교한 유전자 조작 동물에 의지하지 않고 1 주일 이내에 징계 조치를 취했다. 잘 정의 된 Xenopus의 정맥 시스템과 그 고정 관념의 혈관 신생, 기존 혈관의 싹 트기 때문에 혈관의 복잡성은 섭동 실험 후에 효율적으로 정량화 될 수 있습니다. 이 비교적 단순한 프로토콜은 심혈관 연구 분야의 다양한 분야에서 쉽게 접근 할 수있는 도구가되어야합니다.
Introduction
Vasculogenesis, 새로 태어난 endothelial 세포에서 새로운 혈관의 형성, angiogenesis, 선재 혈관에서 새로운 혈관의 형성은 배아 vasculature 1 모양의 두 개의 독특한 프로세스입니다. 이러한 과정에서의 조절 장애는 다양한 심장병 및 혈관의 구조적 비정상을 초래합니다. 또한, 종양 성장은 통제되지 않은 혈관 성장과 관련이있다. 이와 같이, 혈관 신생 및 혈관 신생의 기초가되는 분자 기작은 강렬한 연구 2 의 대상이다.
Xenopus 와 zebrafish는 몇 가지 이유로 vasculogenesis 및 angiogenesis 연구에 대한 매력적인 척추 모델입니다. 첫째, 그들의 배아는 작습니다. 따라서 전체 vasculature를 이미지화하는 것이 상대적으로 쉽습니다. 둘째로, 배아 발달은 빠릅니다. 전체 vasculature가 발달하는 데에는 며칠이 걸리고, 그 동안에 개발 vascul ature를 이미지화 할 수 있습니다. 셋째, antisense morpholino nucleotides (MOs)를 발달중인 배아 또는 약물의 목욕 적용을 통한 미세 주입 (microinjection)과 같이 혈관 형성 전과 도중에 유전 적 및 약리학 적 개입이 쉽게 수행 할 수 있습니다 3 , 4 , 5 .
제노 퍼스가 제브라 피쉬에 비해 갖는 독특한 이점은 Xenopus 가 진핵 적 완전 절편을 따르고 배아의 운명지도가 잘 정의되어 있기 때문에 발생 학적 조작이 수행 될 수 있다는 것입니다. 예를 들어, 2 세포 단계에서 하나의 세포에 안티센스 MO를 주사하여 하나의 옆면 만 유전자 조작 된 배아를 생성 할 수 있습니다. 하나의 배아에서 다른 배아로 심장 원시를 이식하여 유전자가 세포 내재적 또는 흉부 외적 기작에 의해 그 기능을 발휘하는지 여부를 결정하는 것도 가능하다ass = "xref"> 7. 이 기술은 allotetraploid 인 Xenopus laevis 에서 주로 개발되었지만 유전 연구에 이상적이지는 않지만 밀접한 관련이있는 배수체 인 Xenopus tropicalis에 직접 적용될 수 있습니다.
살아있는 Xenopus 배아에서 혈관을 시각화하는 한 가지 방법은 형광 염료를 주입하여 혈관에 라벨을 붙이는 것입니다. DiI와 같은 형광 분자로 표지 된 아세틸 화 된 저밀도 지단백질 (AcLDL)은 매우 유용한 탐침이다. 비 아세틸 화 LDL과 달리, AcLDL은 LDL 수용체 9에 결합하지 않고 대 식세포 및 내피 세포에 의해 엔도시 처리된다. 살아있는 동물의 심장에 DiI – AcLDL의 주입은 내피 세포의 특정 형광 라벨 결과, 그리고 전체 vasculature은 라이브 또는 고정 배아 4 형광 현미경으로 몇 군데하실 수 있습니다.
여기, 우리는Xenopus tropicalis 에서 DiI-AcLDL을 사용하여 혈관을 시각화하고 정량화하기위한 상세한 프로토콜 ( 그림 1 ). 우리는 성공적이고 실패한 실험의 예와 함께 핵심 실용적인 포인트를 제공합니다. 또한 우리는 혈관 네트워크의 형성에 유전 적 및 환경 적 요인의 영향을 평가하는 데 유용한 혈관 복잡성의 정량 분석을위한 직접적인 방법을 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 제시된 프로토콜은 Xenopus laevis 4 에서 혈관 형성 중 발달 과정을 조사하기 위해 Ali H. Brivanlou와 동료에 의해 처음 개발되었지만이 원고에 표시된대로 다른 작은 동물에도 적용 할 수 있습니다. 심장에 염료 주입은 수행하기 쉽고, 전체 혈관 네트워크는 공 촛점 현미경뿐만 아니라 형광 해부 현미경으로 이미징 할 수 있습니다. 염색이 배 발달 동안 심장으로 주입되?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 Levine et al. ,이 실험 방법을 설명하고 Xenopus laevis 에서 혈관 개발에 대한 포괄적 인 설명을 제공했습니다 . 우리는 실험실 구성원의 의견을 감사드립니다. 이 연구는 2015 년 미래의 연구 이니셔티브 (2015-22- 0095)와 과학, ICT 및 미래 기획이 자금을 지원하는 국립 연구 재단 (NRF)의 바이오 및 의료 기술 개발 프로그램 NRF-2013M3A9D5072551)
Materials
| 35mm Petri dish | SPL | 10035 | Sylgard mold frame |
| 60mm Petri dish | SPL | 10060 | Embryo raising tray |
| Borosilicate Glass | Sutter instrument | B100-50-10 | Needle for injection |
| BSA | Sigma | A3059-10G | Coating reagent |
| CaCl2 | D.S.P.GR Reagent | 0.1X MBS component | |
| Coverslip | Superior | HSU-0111520 | For confocal imaging |
| DiI-AcLDL | Thermo Fisher Scientific | L3484 | Vessel staining solution |
| FBS | Hyclone | SH.30919.02 | For storage of testis |
| Fiber Optical Illuminator | World Precision Instruments | Z-LITE-Z | Light |
| Ficoll | Sigma | F4375 | Injection buffer |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter instrument | P-97 | Injection needle puller |
| Forcep | Fine Science Tool | 11255-20 | For embryo hatching and needle tip cutting |
| Glass Bottom dish | SPL | 100350 | For confocal imaging |
| hCG | MNS Korea | For priming of frogs | |
| HEPES | Sigma | H3375 | Buffering agent |
| Incubator | Lab. Companion | ILP-02 | For raising embryos |
| KCl | DAEJUNG | 6566-4400 | MBS component |
| L15 medium | Gibco | 11415-114 | For storage of testis |
| L-cysteine | Sigma | 168149-100G | De-jellying reagent |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | MBS component |
| Microtube | Axygen | MCT-175-C-S | For storage of testis |
| MS222 | Sigma | E10521 | Anesthetic powder |
| NaCl | DAEJUNG | 7647-14-5 | MBS component |
| NaOH | Sigma | S-0899 | pH adjusting reagent |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Fixatives |
| PBS | BIOSESANG | P2007 | Buffer for imaging |
| pH paper | Sigma | P4536-100EA | For confirming pH |
| PICO-LITER INJECTOR | Waner instruments | PLI-100A | For injection |
| Pin | Pinservice | 26002-10 | For incision |
| Pinholder | Scitech Korea | 26016-12 | For incision |
| Precision Stereo Zoom Binocular Microscope | World Precision Instruments | PZMIII | For visual screening |
| Standard Manual Control Micromanipulator | Waner instruments | W4 64-0056 | For microinjection |
| SYLGARD 184 Kit | Dow Corning | For DiI injection | |
| Transfer pipette | Korea Ace Scientific Co. | YM.B78-400 | For eggs and embryo collection |
Referências
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