Visualisering og kvantitativ analyse af embryonisk angiogenese i<em> Xenopus tropicalis</em
Summary
Denne protokol demonstrerer en fluorescensbaseret metode til visualisering af vaskulaturen og kvantificering af dets kompleksitet i Xenopus tropicalis . Blodkar kan billedbehandles minutter efter injektion af et fluorescerende farvestof i et embryos slaghalve efter genetisk og / eller farmakologisk manipulation for at studere kardiovaskulær udvikling in vivo .
Abstract
Blodkar leverer ilt og næringsstoffer i hele kroppen, og dannelsen af det vaskulære netværk er under tæt udviklingskontrol. Den effektive in vivo visualisering af blodkar og den pålidelige kvantificering af deres kompleksitet er nøglen til forståelsen af biologi og sygdom i det vaskulære netværk. Her giver vi en detaljeret metode til visualisering af blodkar med et kommercielt tilgængeligt fluorescerende farvestof, humanplasmaacetyleret lavdensitetslipoprotein DiI-kompleks (DiI-AcLDL) og kvantificering af deres kompleksitet i Xenopus tropicalis . Blodkar kan mærkes ved en simpel injektion af DiI-AcLDL ind i et embryos slagende hjerte, og blodkar i hele embryoet kan afbildes i levende eller faste embryoner. Kombineret med genforstyrrelse ved målrettet mikroinjektion af nukleinsyrer og / eller badapplikationen af farmakologiske reagenser kan et gens eller en signalvejsstats rolle på vaskulær udvikling være invektetSteget inden for en uge uden at ty til sofistikerede genetisk manipulerede dyr. På grund af det veldefinerede venesystem af Xenopus og dets stereotype angiogenese kan spiring af allerede eksisterende skibe, fartøjskompleksitet kvantificeres effektivt efter perturbationsforsøg. Denne relativt enkle protokol skal fungere som et let tilgængeligt værktøj inden for forskellige områder inden for kardiovaskulær forskning.
Introduction
Vasculogenese, dannelsen af nye blodkar fra nyfødte endotelceller og angiogenese, dannelsen af nye fartøjer fra eksisterende skibe, er to forskellige processer, der former embryonisk vaskulatur 1 . Enhver dysregulering i disse processer resulterer i forskellige hjertesygdomme og strukturelle abnormiteter af fartøjer. Endvidere er tumorvækst forbundet med ukontrolleret karvestigning. Som sådan er molekylære mekanismer, der ligger til grund for vaskulogenese og angiogenese, genstand for intens undersøgelse 2 .
Xenopus og zebrafisk er attraktive hvirveldyrsmodeller til vaskulogenese og angiogeneseundersøgelser af flere årsager. For det første er deres embryoner små; Derfor er det relativt nemt at se hele vaskulaturen. For det andet er embryonal udvikling hurtig; Det tager kun et par dage for hele vaskulaturen at udvikle, i hvilket tidsrum den udviklende vaskul Ature kan afbildes. For det tredje er genetiske og farmakologiske interventioner før og under karretdannelse nemme at udføre, såsom gennem mikroinjektion af antisense morpholino nukleotider (MOs) i det udviklende embryo eller gennem badapplikationen af lægemidler 3 , 4 , 5 .
Den unikke fordel ved Xenopus over zebrafisk er, at embryologiske manipulationer kan udføres, fordi Xenopus følger stereotypiske holoblastiske spaltninger, og det embryonske skæbnekort er veldefineret 6 . For eksempel er det muligt at generere et embryo, hvor kun en lateral side er genetisk manipuleret ved at indsprøjte en antisense MO til en celle i tocellefasen. Det er også muligt at transplantere hjertet primordium fra ét embryo til et andet for at bestemme, om genet udøver sin funktion ved hjælp af en celle-iboende eller -ekstruktiv mekanismeAss = "xref"> 7. Selvom disse teknikker hovedsagelig er blevet udviklet i Xenopus laevis , som er allotetraploid og derfor ikke er ideel til genetiske undersøgelser, kan de anvendes direkte til Xenopus tropicalis , en nært beslægtet diploid art 8 .
En måde at visualisere vaskulaturet på i et levende Xenopus embryo er at injicere et fluorescerende farvestof til at mærke blodkarrene. Acetyleret lavdensitetslipoprotein (AcLDL) mærket med et fluorescerende molekyle, såsom DiI, er en meget nyttig probe. I modsætning til ikke-acetyleret LDL binder AcLDL ikke til LDL-receptoren 9, men endocytteres af makrofager og endotelceller. Injektionen af DiI-AcLDL i hjertet af et levende dyr resulterer i den specifikke fluorescerende mærkning af endotelceller, og hele vaskulaturen kan afbildes ved fluorescensmikroskopi i levende eller faste embryoner 4 .
Her præsiderer viEnt detaljerede protokoller til visualisering og kvantificering af blodkar ved anvendelse af DiI-AcLDL i Xenopus tropicalis ( Figur 1 ). Vi giver nøgle praktiske punkter, med eksempler på succesfulde og mislykkede forsøg. Derudover giver vi en retfærdig metode til kvantitativ analyse af vaskulær kompleksitet, hvilket kan være nyttigt ved vurdering af virkningerne af genetiske og miljømæssige faktorer ved udformningen af det vaskulære netværk.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen, der præsenteres her, blev først udviklet af Ali H. Brivanlou og kolleger til at undersøge udviklingshændelser under vaskulær dannelse i Xenopus laevis 4 , men som det fremgår af dette manuskript, kan det anvendes til andre små dyr. Farveinjektion i hjertet er let at udføre, og hele det vaskulære netværk kan afbildes under et fluorescensdissektionsmikroskop, såvel som et konfokalt mikroskop. Hvis farvestoffet injiceres i hjertet under skibets udvikling, kan dynamik…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev inspireret af Levine et al. , Som beskrev denne eksperimentelle metode og gav en omfattende beskrivelse af vaskulær udvikling i Xenopus laevis. Vi takker medlemmerne af vores laboratorium for deres input. Denne undersøgelse blev støttet af Yonsei Universitets Fremtidsforskningsinitiativ fra 2015 (2015-22- 0095) og Biofysisk Udviklingsprogram for National Research Foundation (NRF) finansieret af ministeriet for videnskab, IKT og fremtidig planlægning ( NRF-2013M3A9D5072551)
Materials
| 35mm Petri dish | SPL | 10035 | Sylgard mold frame |
| 60mm Petri dish | SPL | 10060 | Embryo raising tray |
| Borosilicate Glass | Sutter instrument | B100-50-10 | Needle for injection |
| BSA | Sigma | A3059-10G | Coating reagent |
| CaCl2 | D.S.P.GR Reagent | 0.1X MBS component | |
| Coverslip | Superior | HSU-0111520 | For confocal imaging |
| DiI-AcLDL | Thermo Fisher Scientific | L3484 | Vessel staining solution |
| FBS | Hyclone | SH.30919.02 | For storage of testis |
| Fiber Optical Illuminator | World Precision Instruments | Z-LITE-Z | Light |
| Ficoll | Sigma | F4375 | Injection buffer |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter instrument | P-97 | Injection needle puller |
| Forcep | Fine Science Tool | 11255-20 | For embryo hatching and needle tip cutting |
| Glass Bottom dish | SPL | 100350 | For confocal imaging |
| hCG | MNS Korea | For priming of frogs | |
| HEPES | Sigma | H3375 | Buffering agent |
| Incubator | Lab. Companion | ILP-02 | For raising embryos |
| KCl | DAEJUNG | 6566-4400 | MBS component |
| L15 medium | Gibco | 11415-114 | For storage of testis |
| L-cysteine | Sigma | 168149-100G | De-jellying reagent |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | MBS component |
| Microtube | Axygen | MCT-175-C-S | For storage of testis |
| MS222 | Sigma | E10521 | Anesthetic powder |
| NaCl | DAEJUNG | 7647-14-5 | MBS component |
| NaOH | Sigma | S-0899 | pH adjusting reagent |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Fixatives |
| PBS | BIOSESANG | P2007 | Buffer for imaging |
| pH paper | Sigma | P4536-100EA | For confirming pH |
| PICO-LITER INJECTOR | Waner instruments | PLI-100A | For injection |
| Pin | Pinservice | 26002-10 | For incision |
| Pinholder | Scitech Korea | 26016-12 | For incision |
| Precision Stereo Zoom Binocular Microscope | World Precision Instruments | PZMIII | For visual screening |
| Standard Manual Control Micromanipulator | Waner instruments | W4 64-0056 | For microinjection |
| SYLGARD 184 Kit | Dow Corning | For DiI injection | |
| Transfer pipette | Korea Ace Scientific Co. | YM.B78-400 | For eggs and embryo collection |
Referências
- Herbert, S. P., Stainier, D. Y. Molecular control of endothelial cell behaviour during blood vessel morphogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (9), 551-564 (2011).
- Augustin, H. G., Koh, G. Y., Thurston, G., Alitalo, K. Control of vascular morphogenesis and homeostasis through the angiopoietin-Tie system. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (3), 165-177 (2009).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. Arteries and veins: making a difference with zebrafish. Nat Rev Genet. 3 (9), 674-682 (2002).
- Levine, A. J., Munoz-Sanjuan, I., Bell, E., North, A. J., Brivanlou, A. H. Fluorescent labeling of endothelial cells allows in vivo, continuous characterization of the vascular development of Xenopus laevis. Dev Biol. 254 (1), 50-67 (2003).
- Yang, C., et al. Calmodulin Mediates Ca2+-Dependent Inhibition of Tie2 Signaling and Acts as a Developmental Brake During Embryonic Angiogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 36 (7), 1406-1416 (2016).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell-stage Xenopus embryo. Dev Biol. 122 (2), 300-319 (1987).
- Elliott, K. L., Houston, D. W., Fritzsch, B. Transplantation of Xenopus laevis tissues to determine the ability of motor neurons to acquire a novel target. PLoS One. 8 (2), 55541 (2013).
- Grainger, R. M. Xenopus tropicalis as a model organism for genetics and genomics: past, present, and future. Methods Mol Biol. 917, 3-15 (2012).
- Weisgraber, K. H., Innerarity, T. L., Mahley, R. W. Role of lysine residues of plasma lipoproteins in high affinity binding to cell surface receptors on human fibroblasts. J Biol Chem. 253 (24), 9053-9062 (1978).
- Showell, C., Conlon, F. L. Egg collection and in vitro fertilization of the western clawed frog Xenopus tropicalis. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (9), 5293 (2009).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. . Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , (1956).
- Longair, M. H., Baker, D. A., Armstrong, J. D. Simple Neurite Tracer: open source software for reconstruction, visualization and analysis of neuronal processes. Bioinformatics. 27 (17), 2453-2454 (2011).
- Marshak, S., Nikolakopoulou, A. M., Dirks, R., Martens, G. J., Cohen-Cory, S. Cell-autonomous TrkB signaling in presynaptic retinal ganglion cells mediates axon arbor growth and synapse maturation during the establishment of retinotectal synaptic connectivity. J Neurosci. 27 (10), 2444-2456 (2007).
- Cha, H. J., et al. Evolutionarily repurposed networks reveal the well-known antifungal drug thiabendazole to be a novel vascular disrupting agent. PLoS Biol. 10 (8), 1001379 (2012).
- Ny, A., et al. A transgenic Xenopus laevis reporter model to study lymphangiogenesis. Biol Open. 2 (9), 882-890 (2013).
- Bussmann, J., et al. Arteries provide essential guidance cues for lymphatic endothelial cells in the zebrafish trunk. Development. 137 (16), 2653-2657 (2010).
- Li, X. M., Hu, Z., Jorgenson, M. L., Slayton, W. B. High levels of acetylated low-density lipoprotein uptake and low tyrosine kinase with immunoglobulin and epidermal growth factor homology domains-2 (Tie2) promoter activity distinguish sinusoids from other vessel types in murine bone marrow. Circulation. 120 (19), 1910-1918 (2009).
