Live-cell Imaging дегрануляции и секреции тромбоцитов под потоком
Summary
Эта работа описывает метод флуоресцентной микроскопии для изучения адгезии, распространения и секреции тромбоцитов в потоке. Эта универсальная платформа позволяет исследовать функцию тромбоцитов для механистических исследований тромбоза и гемостаза.
Abstract
Тромбоны крови являются важными игроками в гемостазе, образованием тромбов для герметизации сосудистых нарушений. Они также участвуют в тромбозе, образовании тромбов, которые закрывают сосудистую систему и повреждают органы, что приводит к опасным для жизни последствиям. Это мотивирует научные исследования функции тромбоцитов и разработки методов отслеживания клеточно-биологических процессов, происходящих в условиях потока.
Для изучения адгезии и агрегации тромбоцитов имеются две модели потока, два ключевых явления в биологии тромбоцитов. В этой работе описывается метод исследования дегрануляции тромбоцитов в реальном времени при потоке во время активации. В способе используется проточная камера, соединенная с установкой шприцевого насоса, которая помещается под широковолновым инвертированным светодиодным флуоресцентным микроскопом. Описанная здесь установка позволяет одновременно возбуждать множественные флуорофоры, которые доставляются флуоресцентно мечеными антителами или флуоресценциейКрасителей. После экспериментов по визуализации с живой клеткой покровные стекла могут быть дополнительно обработаны и проанализированы с использованием статической микроскопии ( например, конфокальной микроскопии или сканирующей электронной микроскопии).
Introduction
Тромбоциты представляют собой клетки, которые циркулируют в кровотоке. Их основная функция заключается в том, чтобы запечатать сосудистые нарушения на участках травмы и предотвратить потерю крови. На этих участках повреждения субэндотелиальные волокна коллагена подвергаются воздействию и затем покрываются мультимерным белком, фактором фон Виллебранда (VWF). VWF взаимодействует с тромбоцитами, циркулирующими в механизме, который зависит от комплекса гликопротеина Ibα-IX-V на поверхности клетки 1 , замедляя скорость тромбоцитов. Это особенно важно при высоких скоростях сдвига. Тромбоциты впоследствии подвергаются морфологическим изменениям, получая активирующие импульсы из коллагена. Это приводит к необратимому распространению и, в конечном итоге, к агрегации тромбоцитов. Оба процесса зависят от секреции содержимого гранул для облегчения перекрестных помех тромбоцитов. Среди прочего, α-гранулы тромбоцитов содержат фибриноген и VWF для содействия адгезии тромбоцитов и к мостикуТромбоцитов вместе в зависимости от интегрина. Плотные гранулы с тромбоцитами содержат неорганические соединения 2 , включая кальций и аденозиндифосфат (ADP), которые помогают усилить активацию тромбоцитов. Кроме того, тромбоциты содержат медиаторы (аллергического) воспаления 3 , комплементарные контрольные белки 4 и факторы ангиогенеза 5 , 6 , поднимая вопросы о том, как и как эти вещества дифференциально выделяются в различных условиях.
С 1980-х годов исследование функции тромбоцитов в моделях течения было ценным для исследования тромботических механизмов 7 . С тех пор был достигнут значительный технический прогресс, и в настоящее время разрабатываются модели потоков, включающие образование фибрина, для анализа гемостатического потенциала терапевтических концентратов тромбоцитов ex vivo 8 илиИсследовать влияние нарушений в скоростях сдвига на морфологию тромба 9 . Различия в молекулярных и клеточно-биологических механизмах, которые приводят к устойчивой адгезии и физиологическому образованию тромбов (гемостаз) по сравнению с патологическим образованием тромбов (тромбоз), могут быть очень тонкими и мотивировать разработку моделей течения, которые позволяют визуализировать эти субклеточные в реальном времени процессы.
Примером процесса, для которого такая установка была бы ценной, является (повторное) распределение внутриклеточного полифосфата и вербовка факторов свертывания, чтобы выявить зависящее от времени воздействие, которое оно оказывает на ультраструктуру фибрина 10 . Исследования часто ограничиваются анализом конечных точек. Основная цель описанного метода – дать возможность визуального исследования динамических субклеточных процессов в реальном времени, происходящих во время активации тромбоцитов в потоке.
Protocol
Representative Results
Discussion
Во всем мире тромбоз является основной причиной смерти и заболеваемости, а тромбоциты играют центральную роль в его развитии. В этой работе описывается метод визуализации живого изображения дегрануляции тромбоцитов под потоком. Обычно считается, что при активировании тромбоцитов вс?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
КМ признает финансовую поддержку Международной организации пациентов за недостатки C1-ингибитора (HAEi), Stichting Vrienden van Het UMC Utrecht и Фонда Landsteiner для исследования переливания крови (LSBR).
Materials
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | VWR | 441476L | |
| Na2HPO4 | Sigma | S-0876 | |
| NaCl | Sigma | 31434 | |
| KCl | Sigma | 31248 | |
| MgSO4 | Merck KGaA | 1.05886 | |
| D-glucose | Merck KGaA | 1.04074 | |
| Prostacyclin | Cayman Chemical | 18220 | |
| Tri-sodium citrate | Merck KGaA | 1.06448 | |
| Citric acid | Merck KGaA | 1.00244 | |
| Cover glasses | Menzel-Gläser | BBAD02400500#A | 24x50mm, No. 1 = 0.13-0.16 mm thickness. |
| Chromosulfuric acid (2% CrO3) | Riedel de Haen | 07404 | CAS [65272-70-0]. |
| Von Willebrand factor (VWF) | in-house purified | ||
| Fibrinogen | Enzyme Research Laboratories | FIB3L | |
| 4 well dish, non-treated | Thermo Scientific | 267061 | |
| Human Serum Albumin Fraction V | Haem Technologies Inc. | 823022 | |
| Blood collection tubes, 9 ml, 9NC Coagulation Sodium Citrate 3.2% | Greiner Bio-One | 455322 | |
| Cell analyser | Abbott Diagnostics | CELL-DYN hematology analyzer | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus, Holliston, MA | Harvard apparatus 22 | |
| 10 mL syringe with 14.5 mm diameter | BD biosciences | 305959 | Luer-Lok syringe |
| Anti-CD63-biotin | Abcam | AB134331 | |
| Anti-CD62P-biotin | R&D Systems | Dy137 | |
| 4’,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Polysciences Inc. | 9224 | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Scientific | S11223 | |
| Immersion oil | Zeiss | 444963-0000-000 | |
| Detergent solution | Unilever, Biotex | ||
| Glycine | Sigma | 56-40-6 | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma | 9002-89-5 | Mowiol 40-88. |
| Tris hydrochloride | Sigma | 1185-53-1 | |
| 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO) | Sigma | 280-57-9 | |
| Sheep Anti-hVWF pAb | Abcam | AB9378 | |
| Alexa fluor 488-NHS | Thermo Scientific | A20000 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 15523-1L-R | |
| Parafinn film | Bemis | PM-996 | 4 in. x 125 ft. Roll. |
| Silicone sheet non-reinforced | Nagor | NA 500-1 | 200mmx150mmx0.125mm. |
| Customized cut silicone sheet with perfusion and vacuum channels | in-house made | Made of Silicone sheet non-reinforced (Nagor, NA 500-1) | |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf AG | T9661-1000AE | |
| Fluorescent microscope | Zeiss Observer Z1 | Equiped with LED excitation lights. | |
| Microscope software | Zeiss ZEN 2 | blue edition | |
| 18 G needle (18 G x 1 1/2") | BD biosciences | 305196 | |
| NaCl | Riedel de Haen | 31248375 | |
| Tris | Roche | 10708976 | |
| Plastic pasteur pipet | VWR | 612-1681 | 7 ml non sterile, graduated up to 3ml. |
| Silicone tubing | VWR | 228-0656 | Inner diamete. x Outer diameter x Wall thickness = 1.02 x 2.16 x 0.57 mm. |
| Microscope slides | Thermo Scientific | ABAA000001##12E | 76 x 26 x 1 mm, ground edges 45°, frosted end. |
Referências
- Springer, T. A. von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream. Blood. 124 (9), 1412-1425 (2014).
- Fitch-Tewfik, J. L., Flaumenhaft, R. Platelet granule exocytosis: a comparison with chromaffin cells. Front Endocrinol (Lausanne). 4, 11 (2013).
- May, B., Menkens, I., Westermann, E. Differential release of serotonin and histamine from blood platelets of the rabbit by aliphatic and aromatic amines. Life Sci. 6 (19), 2079-2085 (1967).
- Schmaier, A. H., Smith, P. M., Colman, R. W. Platelet C1- inhibitor. A secreted alpha-granule protein. J. Clin. Invest. 75 (1), 242-250 (1985).
- Battinelli, E. M., Markens, B. A., Italiano, J. E., et al. Release of angiogenesis regulatory proteins from platelet alpha granules: modulation of physiologic and pathologic angiogenesis. Blood. 118 (5), 1359-1369 (2011).
- Kamykowski, J., Carlton, P., Sehgal, S., Storrie, B. Quantitative immunofluorescence mapping reveals little functional coclustering of proteins within platelet α-granules. Blood. 118 (5), 1370-1373 (2011).
- Sakariassen, K. S., Aarts, P. A., de Groot, P. G., Houdijk, W. P., Sixma, J. J. A perfusion chamber developed to investigate platelet interaction in flowing blood with human vessel wall cells, their extracellular matrix, and purified components. J Lab Clin Med. 102 (4), 522-535 (1983).
- Van Aelst, B., Feys, H. B., Devloo, R., Vandekerckhove, P., Compernolle, V. Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro. J Vis Exp. (109), (2016).
- Nesbitt, W. S., Westein, E., et al. A shear gradient-dependent platelet aggregation mechanism drives thrombus formation. Nat Med. 15 (6), 665-673 (2009).
- Mitchell, J. L., Lionikiene, A. S., et al. Polyphosphate colocalizes with factor XII on platelet-bound fibrin and augments its plasminogen activator activity. Blood. 128 (24), 2834-2845 (2016).
- Park, Y., Schoene, N., Harris, W. Mean platelet volume as an indicator of platelet activation: methodological issues. Platelets. 13 (5-6), 301-306 (2002).
- Sixma, J. J., de Groot, P. G., van Zanten, H., IJsseldijk, M. A new perfusion chamber to detect platelet adhesion using a small volume of blood. Thromb Res. 92, S43-S46 (1998).
- Slack, S. M., Turitto, V. T. Flow chambers and their standardization for use in studies of thrombosis. On behalf of the Subcommittee on Rheology of the Scientific and Standardization Committee of the ISTH. Thromb Haemost. 72 (5), 777-781 (1994).
- Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy: present technology and future trends. Methods Cell Biol. 123, 153-175 (2014).
- Nishibori, M., Cham, B., McNicol, A., Shalev, A., Jain, N., Gerrard, J. M. The protein CD63 is in platelet dense granules, is deficient in a patient with Hermansky-Pudlak syndrome, and appears identical to granulophysin. J. Clin. Invest. 91 (4), 1775-1782 (1993).
- Ruiz, F. A., Lea, C. R., Oldfield, E., Docampo, R. Human platelet dense granules contain polyphosphate and are similar to acidocalcisomes of bacteria and unicellular eukaryotes. J. Biol. Chem. 279 (43), 44250-44257 (2004).
- Tersteeg, C., Fijnheer, R., et al. Keeping von Willebrand Factor under Control: Alternatives for ADAMTS13. Semin Thromb Hemost. 42 (1), 9-17 (2016).
- Tersteeg, C., de Maat, S., et al. Plasmin cleavage of von Willebrand factor as an emergency bypass for ADAMTS13 deficiency in thrombotic microangiopathy. Circulation. 129 (12), 1320-1331 (2014).
- Basir, A., de Groot, P., et al. In Vitro Hemocompatibility Testing of Dyneema Purity Fibers in Blood Contact. Innovations (Phila). 10 (3), 195-201 (2015).
