Сборка и отслеживание развития микробного сообщества в рамках платформы массивов микролистов
Summary
Развитие микробных сообществ зависит от сочетания факторов, включая экологическую архитектуру, численность членов, черты и взаимодействия. В этом протоколе описывается синтетическая микроструктурированная среда для одновременного отслеживания тысяч сообществ, содержащихся в ямах фемтолитера, где могут быть аппроксимированы ключевые факторы, такие как размер ниши и ограничение.
Abstract
Развитие микробных сообществ зависит от сочетания сложных детерминированных и стохастических факторов, которые могут кардинально изменить пространственное распределение и деятельность членов сообщества. Мы разработали платформу массива microwell, которая может использоваться для быстрой сборки и отслеживания тысяч бактериальных сообществ параллельно. В этом протоколе подчеркивается полезность платформы и описывается ее использование для оптического мониторинга развития простых сообществ из двух членов в составе массивов в рамках платформы. Эта демонстрация использует два мутанта Pseudomonas aeruginosa , часть серии мутантов, разработанных для изучения патогенности секреции типа VI. Хромосомные вставки генов mCherry или GFP облегчают конститутивную экспрессию флуоресцентных белков с четкими длинами волн излучения, которые могут использоваться для мониторинга численности и местоположения членов сообщества в каждом микролухе. Этот протокол описывает подробный методD для сборки смесей бактерий в лунки массива и использования временной флуоресцентной визуализации и количественного анализа изображений для измерения относительного роста популяции каждого члена с течением времени. Посев и сборка платформы microwell, процедуры визуализации, необходимые для количественного анализа микробных сообществ внутри массива, и методы, которые могут быть использованы для выявления взаимодействий между областью микробных видов, обсуждались.
Introduction
Микробные сообщества формируются как детерминированными факторами, такими как структура окружающей среды, так и стохастическими процессами, которые связаны с гибелью клеток, делением, концентрацией белка, количеством органелл и мутацией 1 . В естественной среде практически невозможно проанализировать индивидуальное воздействие этих влияний на состав и деятельность сообщества. Замаскированные естественными структурами и погребенные в химической и биологической среде, выявление членов сообщества и дальнейшее разрешение их пространственно-временного распределения в естественной среде чрезвычайно сложны. Тем не менее, недавние усилия подчеркнули важность пространственной организации для функционирования сообщества и указывают на необходимость учета как численности, так и организации в текущих исследованиях 2 , 3 , 4 .
ЭтоЯсно, что локальная химическая среда ( то есть доступность питательных веществ и вторичных метаболитов), физическая структура ( например, почвенная архитектура, корни растений, частицы океана или кишечные микроворсинки), наличие или отсутствие кислорода и введение Патогенные виды влияют на состав, архитектуру и функцию микробных сообществ 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . Тем не менее традиционные методы для культур, которые пренебрегают этим фактором, продолжают преобладать. Состав сообщества ( например, наличие со-зависимых видов), физическое прикрепление, концентрация сигнальной молекулы и прямой контакт клеток-клеток являются важными факторами формирования микробного сообщества и могут быть потеряны в cОбщепринятые условия культивирования. Эти свойства трудно реплицировать в объемной жидкой культуре или на агаровой пластине. Тем не менее, наличие микрофлюидных, микронапряжений и технологий нанообработки, которые позволяют реплицировать ключевые физические и химические свойства природных сред, позволило многим исследователям построить сообщества бактерий для изучения их взаимодействий 12 , 13 , 14 и разработать синтетические среды, которые Имитировать природные условия 4 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 .
В этом протоколе описан способ изготовления устройства массива микроволн и подробные экспериментальные процедуры, которые могут быть использованы для функционализацииE колодцев в массиве и выращивать бактерии, как колонии одного вида, так и в сообществах с несколькими членами. Эта работа также демонстрирует, как бактерии, модифицированные для получения флуоресцентных репортерных белков, могут использоваться для мониторинга роста бактерий в лунках с течением времени. Аналогичный массив был представлен ранее и показал, что можно отслеживать рост одновидовых колоний Pseudomonas aeruginosa ( P. aeruginosa) в микролунках. Путем модуляции плотности и плотности посева начальные условия тысяч экспериментов по росту могут варьироваться параллельно, чтобы определить, как исходные условия инокуляции влияют на способность бактерий расти 21 . Текущая работа использует слегка измененную версию массива микроячейки, которая основывается на предыдущей работе, позволяя одновременное сравнение нескольких массивов и используя более надежный экспериментальный протокол. Массив, используемый в этой работе, содержит несколько подмассивов или массивСодержащие лунки разного размера, от 15 до 100 мкм в диаметре, которые расположены на трех разных смолах ( т.е. 2x, 3x и 4x диаметр скважины). Массивы выгравированы в кремнии, а рост бактерий, засеянных в кремниевых массивах, обеспечивается запечатыванием массивов с покровным стеклом, покрытым агарозным гелем с средней интенсивностью. В этой демонстрации используются мутанты P. aeruginosa, предназначенные для изучения системы секреции типа VI.
Представленные здесь результаты направлены на достижение конечной цели анализа сообществ многочленов в массивах матриц микроволн, что позволяет исследователям контролировать численность и организацию бактерий in situ , контролируя и исследуя химическую среду. Это должно в конечном итоге дать представление о «правилах», которые регулируют развитие и преемственность сообщества.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой статье представлено устройство с микроволновыми решетками и экспериментальные протоколы, предназначенные для высокопроизводительного и высокоточного анализа изображений на основе живых клеток на основе бактериальных сообществ. В то время как в центре внимания демонстрации ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Массивы Microwell были сфабрикованы и охарактеризованы в Отделе пользовательских услуг Центра нанофазных материалов, Управление по основным энергетическим наукам Министерства энергетики США. Финансовая поддержка этой работы была оказана через Фонд исследований и развития директора Национальной библиотеки Оук-Ридж. Авторы также хотели бы поблагодарить лабораторию J. Mougous (Вашингтонский университет, Сиэтл, штат Вашингтон) за поставку штаммов P. aeruginosa, используемых в этих исследованиях .
Materials
| Parylene N | Specialty Coating Systems | CAS NO.:1633-22-3 |
| Parylene coater | Specialty Coating Systems | Labcoter 2 Parylene Deposition Unit PDS2010 |
| Silicon Wafer | WRS Materials | 100mm diameter, 500-550μm thickness, Prime, 10-20 resistivity, N/Phos<100>, |
| adhesion promoter | Shin-Etsu Microsci | MicroPrime P20 adhesion promoter |
| postive tone photoresist | Rohm and Haas Electronics Materials LLC (Owned by Dow) | Microposit S1818 Positive Photoresist (code 10018357) |
| Quintel Contact Aligner | Neutronix Quintel Corp | NXQ 7500 Mask Aligner |
| Reactive Ion Etching Tool | Oxford Instruments | Plasmalab System 100 Reactive Ion Etcher |
| R2A Broth | TEKnova | R0005 |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 |
| Multimode Plate Reader | Perkin Elmer | Enspire, 2300-0000 |
| Fluorescent Microscope | Nikon | Eclipse Ti-U |
| Automated Stage | Prior | ProScan III |
| CCD camera | Nikon | DS-QiMc |
| Stage-top environmental control chamber | In Vivo Scientific | STEV ECU-HOC |
| Phosphate Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 14190144 |
| UltraPure Agarose | ThermoFisher Scientific | 16500500 |
| 25 x 75 mm No. 1.5 coverslip | Nexterion | High performance #1.5H coverslips |
| Fluorescence Reference Slides | Ted Pella | 2273 |
| Physical Stylus Profilometer | KLA Tencor | P-6 |
| lab wipes | Kimberly Clark | Kimipe KIMTECH SCIENCE Brand, 34155 |
| commercial software | Nikon | NIS Elements |
| Zeiss 710 Confocal Microscope | Zeiss | |
| filter cubes | Nikon | Nikon FITC (96311), Nikon Texas Red(96313) |
Referências
- Zhou, J., Deng, Y., et al. Stochasticity, succession, and environmental perturbations in a fluidic ecosystem. Proc Natl Acad Sci. 111, E836-E845 (2014).
- Valm, A. M., Welch, J. L. M., et al. Systems-level analysis of microbial community organization through combinatorial labeling and spectral imaging. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (10), 4152-4157 (2011).
- Satoh, H., Miura, Y., Tsushima, I., Okabe, S. Layered structure of bacterial and archaeal communities and their in situ activities in anaerobic granules. Appl Environ Microbiol. 73 (22), 7300-7307 (2007).
- Kim, H. J., Boedicker, J. Q., Choi, J. W., Ismagilov, R. F. Defined spatial structure stabilizes a synthetic multispecies bacterial community. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (47), 18188-18193 (2008).
- Nunan, N., Wu, K., Young, I. M., Crawford, J. W., Ritz, K. Spatial distribution of bacterial communities and their relationships with the micro-architecture of soil. FEMS Microbiol Ecol. 44, 203-215 (2003).
- Grundmann, G. L. Spatial scales of soil bacterial diversity – The size of a clone. FEMS Microbiol Ecol. 48, 119-127 (2004).
- Langenheder, S., Lindstrom, E. S., Tranvik, L. J. Structure and Function of Bacterial Communities Emerging from Different Sources under Identical Conditions. Appl Environ Microbiol. 72 (1), 212-220 (2006).
- Camp, J. G., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. Patterns and Scales in Gastrointestinal Microbial Ecology. Gastroenterology. 136 (6), 1989-2002 (2009).
- Renner, L. D., Weibel, D. B. Physicochemical regulation of biofilm formation. MRS Bull. 36 (5), 347-355 (2011).
- Wessel, A. K., Hmelo, L., Parsek, M. R., Whiteley, M. Going local: technologies for exploring bacterial microenvironments. Nat Rev Microbiol. 11 (5), 337-348 (2013).
- Stacy, A., McNally, L., Darch, S. E., Brown, S. P., Whiteley, M. The biogeography of polymicrobial infection. Nat Rev Microbiol. 14 (2), 93-105 (2015).
- Hansen, R. R., Shubert, K. R., Morrell-Falvey, J. L., Lokitz, B. S., Doktycz, M. J., Retterer, S. T. Microstructured block copolymer surfaces for control of microbe adhesion and aggregation. Biosensors. 4 (1), 63-75 (2014).
- Hansen, R. R., Hinestrosa, J. P., et al. Lectin-functionalized poly(glycidyl methacrylate)- block -poly(vinyldimethyl azlactone) surface scaffolds for high avidity microbial capture. Biomacromolecules. 14 (10), 3742-3748 (2013).
- Timm, C. M., Hansen, R. R., Doktycz, M. J., Retterer, S. T., Pelletier, D. A. Microstencils to generate defined, multi-species patterns of bacteria. Biomicrofluidics. 9 (6), (2015).
- Keymer, J. E., Galajda, P., Muldoon, C., Park, S., Austin, R. H. Bacterial metapopulations in nanofabricated landscapes. Proc Natl Acad Sci USA. 103 (46), 17290-17295 (2006).
- Zhang, Q., Lambert, G., et al. Acceleration of Emergence of Bacterial Antibiotic Resistance in Connected Microenvironments. Science. 333 (6050), 1764-1767 (2011).
- Friedlander, R. S., Vlamakis, H., Kim, P., Khan, M., Kolter, R., Aizenberg, J. Bacterial flagella explore microscale hummocks and hollows to increase adhesion. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (14), 5624-5629 (2013).
- Zhou, J., Liu, W., et al. Stochastic Assembly Leads to Alternative Communities with Distinct Functions in a Bioreactor Microbial Community. MBio. 4 (2), 1-8 (2013).
- van Vliet, S., Hol, F. J., Weenink, T., Galajda, P., Keymer, J. E. The effects of chemical interactions and culture history on the colonization of structured habitats by competing bacterial populations. BMC Microbiol. 14 (1), 116 (2014).
- Niepa, T. H. R., Hou, L., et al. Microbial Nanoculture as an Artificial Microniche. Sci Rep. 6, 30578 (2016).
- Hansen, R. H., Timm, A. C., et al. Stochastic Assembly of Bacteria in Microwell Arrays Reveals the Importance of Confinement in Community Development. PLoS ONE. 11 (5), e0155080 (2016).
- Hood, R. D., Singh, P., et al. A Type VI Secretion System of Pseudomonas aeruginosa Targets a Toxin to Bacteria. Cell Host Microbe. 7 (1), 25-37 (2010).
- LeRoux, M., Ja De Leon, ., et al. Quantitative single-cell characterization of bacterial interactions reveals type VI secretion is a double-edged sword. Proc Natl Acad Sci. 109 (48), 19804-19809 (2012).
- Whitney, J. C., Beck, C. M., et al. Genetically distinct pathways guide effector export through the type VI secretion system. Mol Microbiol. 92 (3), 529-542 (2014).
- Warrick, J. W., Timm, A., Swick, A., Yin, J. Tools for Single-Cell Kinetic Analysis of Virus-Host Interactions. PLoS ONE. 11 (1), e0145081 (2016).
- Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., Van’t Riet, K. Modeling of the Bacterial Growth Curve. Appl Environ Microbiol. 56 (6), 1875-1881 (1990).
- Halsted, M., Wilmoth, J. L., et al. Development of transparent microwell arrays for optical monitoring and dissection of microbial communities. J Vac Sci Technol B Nanotechnol Microelectron. 34 (6), 06KI03 (2016).
