마이크로 웰 어레이 플랫폼 내 미생물 공동체 개발의 구성 및 추적
Summary
미생물 군집의 개발은 환경 구조, 구성원의 풍부 성, 형질 및 상호 작용을 포함하는 여러 요소의 조합에 달려있다. 이 프로토콜은 틈새 크기 및 감금과 같은 핵심 요소가 근사 될 수있는 femtoliter 우물에 포함 된 수천 개의 공동체를 동시에 추적하기위한 합성, 미세 제작 환경을 설명합니다.
Abstract
미생물 군집의 개발은 공동체 구성원의 공간 분포와 활동을 극적으로 바꿀 수있는 복잡한 결정 론적 요인과 확률 론적 요인의 조합에 달려있다. 우리는 수천 개의 세균 공동체를 신속하게 조립하고 추적하는 데 사용할 수있는 마이크로 웰 어레이 플랫폼을 개발했습니다. 이 프로토콜은 플랫폼의 유용성을 강조하고 플랫폼 내의 배열 앙상블 내에서 간단한 2 인 커뮤니티의 개발을 광학적으로 모니터링하기위한 용도를 설명합니다. 이 시연은 유형 VI 분비 병원성을 연구하기 위해 개발 된 일련의 돌연변이 체의 일부인 Pseudomonas aeruginosa 의 두 가지 돌연변이 체를 사용합니다. mCherry 또는 GFP 유전자의 염색체 삽입물은 각 마이크로 웰 내에서 커뮤니티 구성원의 풍부 성과 위치를 모니터링하는 데 사용할 수있는 별개의 방출 파장을 지닌 형광 단백질의 구성 적 발현을 촉진합니다. 이 프로토콜은 상세한 메토d 어레이의 우물에 박테리아의 혼합물을 조립하고 시간 경과에 따른 각 구성원의 상대적 성장을 측정하기 위해 시간 경과 형광 이미징 및 정량적 이미지 분석을 사용합니다. 마이크로 웰 플랫폼의 파종 및 조립, 어레이 내 미생물 군집의 정량 분석에 필요한 이미징 절차 및 모두 논의 된 미생물 종간의 상호 작용을 밝힐 수있는 방법.
Introduction
미생물 군집은 환경의 구조, 세포 사멸, 분열, 단백질 농도, 세포 소기관 수 및 돌연변이와 관련된 확률 적 과정과 같은 결정 론적 요인에 의해 형성된다. 자연 환경에서 이러한 영향이 지역 사회의 구성과 활동에 미치는 영향을 분석하는 것은 거의 불가능합니다. 자연 구조에 의해 가려지고 화학 및 생물학적 환경에 묻혀 지역 공동체 구성원을 확인하고 자연 환경 내에서 시공간적 분포를 해결하는 것은 매우 어렵습니다. 그럼에도 불구하고 최근의 노력은 지역 사회 기능에 대한 공간 조직의 중요성을 강조하고 진행중인 연구 2 , 3 , 4 에서 회원 수와 조직 모두를 설명 할 필요성을 지적했다.
그것( 예 : 토양 구조, 식물 뿌리, 해양 입자 또는 장 미세 덩어리), 산소의 존재 또는 부재, 그리고 미생물의 도입과 같은 화학적 환경 ( 즉 , 영양소와 이차 대사 산물의 이용 가능성) 병원성 종은 모두 미생물 군집의 구성, 구조 및 기능에 영향을 미친다. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . 그럼에도 불구하고 이러한 요소를 포착하는 것을 게을리하는 전통 문화 기술은 계속해서 널리 퍼집니다. 공동체 구성 ( 예 : 공존하는 종의 존재), 물리적 부착, 신호 분자 농도 및 직접 세포 – 세포 접촉은 모두 미생물 군집 형성에 중요한 요소이며 c예방 적 문화 조건. 이러한 특성은 대량 액체 배양 또는 한천 플레이트에서 복제하기가 어렵습니다. 그러나 자연 환경의 주요 물리적 및 화학적 특성을 복제 할 수있는 미세 유체, 미세 패터닝 및 나노 제작 기술을 이용할 수있게 됨으로써 많은 연구자들이 박테리아 공동체를 구축하여 상호 작용을 연구하고 상호 작용을 연구하고 합성 환경을 개발할 수있었습니다. 자연 조건 4 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20을 모방한다.
이 프로토콜은 microwell 배열 장치를 조작하는 방법을 설명하고 th 기능화하는 데 사용할 수있는 자세한 실험 절차를 제공합니다e 웰을 배열하고 박테리아를 단일 종의 식민지와 다중 구성원 공동체로 성장시킬 수 있습니다. 이 연구는 또한 형광 리포터 단백질을 생산하기 위해 변형 된 박테리아가 시간이 지남에 따라 웰 내의 박테리아 성장을 모니터링하는 데 어떻게 사용될 수 있는지를 보여줍니다. 유사한 배열이 이전에 제시되었고 마이크로 웰에서 녹농균 ( Pseudomonas aeruginosa) ( P. aeruginosa) 의 단일 종 콜로니의 성장을 추적하는 것이 가능하다는 것을 보여 주었다. 웰 크기와 파종 밀도를 조절함으로써 초기 접종 조건이 박테리아의 성장 능력에 어떻게 영향을 주는지를 결정하기 위해 수 천 번의 성장 실험의 시작 조건을 병렬로 변화시킬 수 있습니다 21 . 현재 연구는 다중 배열의 동시 비교를 가능하게하고보다 견고한 실험 프로토콜을 사용함으로써 이전 연구를 기반으로하는 마이크로 웰 어레이의 약간 수정 된 버전을 사용합니다. 이 저작물에 사용 된 배열은 여러 개의 하위 배열 또는 배열 ensem을 포함합니다.(직경 2x, 3x 및 4x의 우물 직경)로 배열 된 직경이 15 – 100 μm 인 다양한 크기의 우물을 포함하고 있습니다. 어레이는 실리콘으로 에칭되고, 실리콘 어레이에 시드 된 박테리아의 증식은 매체 주입 아가로 오스 겔로 코팅 된 커버 슬립으로 어레이를 밀봉함으로써 가능해진다. Type Ⅵ 분비 시스템을 연구하기 위해 설계된 P. aeruginosa 돌연변이 체는이 시연에서 사용됩니다.
여기에 제시된 결과는 마이크로 웰 어레이 내에서 다중 구성원 커뮤니티를 분석하는 궁극적 인 목표를 향해 만들어졌으며 연구원은 화학 환경을 제어 및 프로빙하면서 현장 에서 박테리아의 풍부 성과 조직을 모니터링 할 수있었습니다. 이것은 궁극적으로 지역 사회 개발과 승계를 지배하는 "규칙"에 대한 통찰력을 제공해야합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 기사에서는 박테리아 공동체 개발에 대한 높은 처리량 및 고감도 생체 이미징 기반 분석을 가능하게하도록 설계된 마이크로 웰 어레이 장치 및 실험 프로토콜을 발표했습니다. 여기 시위의 초점은 지역 사회 개발에 접촉 매개 형 VI 형 분비의 효과를 연구하는 것이었지만, 배열은 유연하고 다양한 미생물 군집 및 미생물 – 미생물 상호 작용에 대한 연구를 수용하도록 설계되었습니다. 여기에서…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Microwell 배열은 미국 에너지 부 기본 에너지 과학 사무실의 Nanophase Materials Sciences 사용자 시설 부문 센터에서 제조 및 특성 분석되었습니다. 이 연구에 대한 재정 지원은 Oak Ridge 국립 연구소의 연구 개발 기금을 통해 제공되었습니다. 저자들은 또한이 연구에 사용 된 P. aeruginosa 균주의 공급에 대해 J. Mougous Laboratory (Washington, Seattle, WA)에 감사 드리고자 합니다.
Materials
| Parylene N | Specialty Coating Systems | CAS NO.:1633-22-3 |
| Parylene coater | Specialty Coating Systems | Labcoter 2 Parylene Deposition Unit PDS2010 |
| Silicon Wafer | WRS Materials | 100mm diameter, 500-550μm thickness, Prime, 10-20 resistivity, N/Phos<100>, |
| adhesion promoter | Shin-Etsu Microsci | MicroPrime P20 adhesion promoter |
| postive tone photoresist | Rohm and Haas Electronics Materials LLC (Owned by Dow) | Microposit S1818 Positive Photoresist (code 10018357) |
| Quintel Contact Aligner | Neutronix Quintel Corp | NXQ 7500 Mask Aligner |
| Reactive Ion Etching Tool | Oxford Instruments | Plasmalab System 100 Reactive Ion Etcher |
| R2A Broth | TEKnova | R0005 |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 |
| Multimode Plate Reader | Perkin Elmer | Enspire, 2300-0000 |
| Fluorescent Microscope | Nikon | Eclipse Ti-U |
| Automated Stage | Prior | ProScan III |
| CCD camera | Nikon | DS-QiMc |
| Stage-top environmental control chamber | In Vivo Scientific | STEV ECU-HOC |
| Phosphate Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 14190144 |
| UltraPure Agarose | ThermoFisher Scientific | 16500500 |
| 25 x 75 mm No. 1.5 coverslip | Nexterion | High performance #1.5H coverslips |
| Fluorescence Reference Slides | Ted Pella | 2273 |
| Physical Stylus Profilometer | KLA Tencor | P-6 |
| lab wipes | Kimberly Clark | Kimipe KIMTECH SCIENCE Brand, 34155 |
| commercial software | Nikon | NIS Elements |
| Zeiss 710 Confocal Microscope | Zeiss | |
| filter cubes | Nikon | Nikon FITC (96311), Nikon Texas Red(96313) |
Referências
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