Agujas personalizadas para microinyecciones en el cerebro de roedor
Summary
Describimos aquí un protocolo para la microinyección en el cerebro de roedor que utiliza agujas de cuarzo. Estas agujas no producen daño tisular detectable y asegurar la entrega confiable incluso en regiones profundas. Además, pueden ser adaptados a las necesidades de investigación por diseños personalizados y se pueden volver a utilizarse.
Abstract
Microinjertos se han utilizado durante mucho tiempo para la entrega de medicamentos o toxinas dentro de áreas específicas del cerebro y, más recientemente, se han utilizado para entregar productos de terapia génica o celular. Desafortunadamente, las técnicas de microinyección actuales usan agujas de acero o vidrio que son subóptimas por múltiples razones: en particular, agujas de acero pueden causar daño tisular, y agujas de vidrio pueden doblar cuando baja profundamente en el cerebro, falta la región objetivo. En este artículo se describe un protocolo para preparar y utilizar agujas de cuarzo que combinan un número de características útiles. Estas agujas no producen daño tisular detectable y, siendo muy rígido, asegurar una entrega confiable en la región del cerebro deseado aun cuando estén usando coordenadas profundos. Por otra parte, es posible personalizar el diseño de la aguja haciendo varios agujeros del diámetro deseado. Múltiples orificios facilitan la inyección de grandes cantidades de solución dentro de un área más grande, mientras que grandes agujeros facilitan la inyección de las células. Además, estas agujas de cuarzo se pueden limpiar y volver a utilizarse, tal que el procedimiento se convierte en rentable.
Introduction
Microinjertos se han utilizado durante mucho tiempo para la entrega de compuestos farmacológicamente activos para modular la actividad neuronal en áreas específicas del cerebro. Además, se han utilizado para inyectar toxinas cerca de poblaciones neuronales particulares, imitar neurodegenerativas eventos característicos de ciertas enfermedades, por ejemplo 6-hidroxi-dopamina en el sistema de dopamina nigroestriatal para imitar la enfermedad de Parkinson 1 , 2 o la inmunotoxina 192 IgG saporin a lesión del sistema colinérgico3. Más recientemente, se han utilizado procedimientos de microinyección para ofrecer injertos vectores o células virales para la terapia génica o celular cerebral experimental trastornos4,5.
El tipo clásico de agujas empleadas en estos estudios se hace del acero inoxidable. Aunque fácil y práctico uso, agujas de acero tienen una serie de problemas6: son relativamente grandes y pueden causar daño a los tejidos, con pérdida de la barrera hemato – encefálica y la activación de astrocitos; por otra parte, pueden producir perforación del tejido cerebral que se mete en la aguja, creando un obstáculo o incluso completamente evitando el flujo de la solución deseada. Más recientemente, las agujas de vidrio preparados ad hoc de los capilares se han introducido en usan7,8. Estos no causan activación daño ni astrositos de tejido importante, pero son relativamente flexibles y pueden doblar cuando en estructuras profundas, reduciendo la precisión de la localización (observaciones personales).
Por lo tanto hay una necesidad de reducir tanto como posibles daños (sobre todo al realizar experimentos para curar daños) aumentando la precisión y la reproducibilidad (es decir, asegurar que se entrega toda la solución y asegurar la correcta localización). Por otra parte, sería deseable utilizar diseños diferentes para asegurar la distribución óptima de la solución inyectada en áreas cerebrales con diferentes geometrías. En este artículo se describe un protocolo para preparar y utilizar agujas de cuarzo de microinyecciones en el cerebro de roedor. Debido al alto punto de fusión, cuarzo tubos capilares no se tiró en un extractor convencional y por lo tanto, no se han utilizado en el pasado para generar las agujas. Cuarzo, sin embargo, ofrece algunas ventajas importantes sobre vidrio, en particular de alta rigidez y ruptura de resistencia9. Debido a su rigidez, agujas de cuarzo son ideales para las inyecciones en las regiones del cerebro ventral. Debido a su alta resistencia a la rotura puede ser modelados para incluir múltiples agujeros, obtener diseños que pueden resultar más efectivos aún cuando las regiones del cerebro con geometrías complejas10.
Protocol
Representative Results
Discussion
La técnica descrita en este artículo cumple con las necesidades descritas en la Introducción para la optimización de microinyecciones que se realizan para diversos fines12. Las agujas que se describe aquí reducen el daño a un nivel mínimo, esencialmente no detectables; varianza con agujas de vidrio (que son propensos a la curva), agujas de cuarzo son rígidas y aseguran un golpe confiable de la región del cerebro deseado incluso en coordenadas profundos. Por otra parte, el…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo ha sido apoyado por una subvención de la Comunidad Europea [Proyecto FP7-PEOPLE-2011-IAPP 285827 (EPIXCHANGE)].
Materials
| Quartz capillaries | Sutter Instruments, Novato, CA USA | Q100-50-10 | Without filament |
| Puller | Sutter | P2000 | |
| Micropipette storage jar | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | E210 | |
| Laser microdissector | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | LMD6500 | |
| Hamilton syringe | Hamilton ILS Innovative Labor Systeme GmbH, StŸtzerbach, Germany | 19138-U | |
| Microinfusion pump | Univentor, Zejtun, Malta | Model 864 | |
| Manual microinjection pump kit | WPI | Item#: MMP-KIT | Kit allowing for micropipettes to be securely mounted to the stereotactic frame |
| Precision Drill | Proxxon | 28510 MicroMot 50/E | Ball bearing drive shaft with variable speed |
| Artficial Cerebral Spinal Fluid | Tocris | 3525 | |
| Needles 26 G Blunt and 30 G Bevel | Hamilton | 26 G Blunt: 19138-U 30 G Bevel: 20757 |
|
| Microtome | Leica, Germany | LEICA RM212RT |
Referências
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