Descrevemos aqui um protocolo para o microinjection do cérebro de roedores que usa agulhas de quartzo. Estas agulhas não produzir dano tecidual detectável e assegurar a entrega confiável, mesmo em regiões profundas. Além disso, eles podem ser adaptados às necessidades de pesquisa pelos projetos personalizados e podem ser reutilizados.
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Artigo de método
Agulhas personalizadas para alevinos do cérebro de roedor
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Microinjeções têm sido utilizadas por um longo tempo para a entrega de drogas ou toxinas dentro de áreas específicas do cérebro e, mais recentemente, eles têm sido utilizados para entregar produtos de terapia genética ou célula. Infelizmente, as técnicas de microinjeção atual usar agulhas de aço ou vidro, que são de qualidade inferior por várias razões: em particular, agulhas de aço podem causar danos nos tecidos e agulhas de vidro podem dobrar quando abaixado profundamente no cérebro, ausente da região de destino. Neste artigo, descrevemos um protocolo para preparar e usar agulhas de quartzo que combinam um número de características úteis. Estas agulhas não produzir dano tecidual detectável e, sendo muito rígida, garantir a entrega confiável na região desejada cérebro mesmo quando usando coordenadas profundas. Além disso, é possível personalizar o design da agulha, fazendo vários furos do diâmetro desejado. Vários furos facilitam a injeção de grandes quantidades de solução dentro de uma área maior, Considerando que grandes buracos facilitam a injeção de células. Além disso, estas agulhas de quartzo podem ser limpos e reutilizadas, tal que o procedimento se torna rentável.
Introdução
Microinjeções têm sido utilizadas por um longo tempo para a entrega de compostos farmacologicamente ativos de modular a atividade neuronal em áreas específicas do cérebro. Além disso, eles têm sido usados para injetar toxinas perto de populações neuronais particulares, para imitar neurodegenerativas eventos característicos de determinadas doenças, por exemplo 6-hidroxi-dopamina no sistema de dopamina nigrostriatal para imitar a doença de Parkinson 1 , 2 ou o saporin de IgG immunotoxin 192 a lesão do sistema colinérgico3. Mais recentemente, procedimentos de microinjeção tem sido usados p....
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Protocolo
Todos os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comité de ética da Universidade de Ferrara para a experimentação Animal e pelo Ministério da saúde italiano. A chegada (pesquisa Animal: Reporting em experimentos Vivo11) orientações foram seguidas.
1. preparação de agulhas de quartzo
- Limpar e esterilizar os capilares de quartzo (ver Tabela de materiais), colocando-os por 5 min em água destilada, 5 min em 99% de etanol e 5 min em éter dietílico.
- Deixe os capilares sob o capô pelo menos 1 h para deixá-los secar completamente.
- Prepare as agulhas usando um extrator de l....
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Resultados
Comparamos os danos induzidos por microinjeção direta no hipocampo dorsal de rato e striatum usando uma agulha de quartzo (ponta de diâmetro externo 60 µM; buraco de lado um 20 µM de diâmetro e tipo C, Figura 1), em comparação com dois clássico, fim brusco 26 G e borda chanfrada de 30 G agulhas de aço inoxidável. Para este objectivo, injetamos 2 µ l de aCSF na direita e deixou o hipocampo dorsal e striatum usando respectivamente o quartzo e a agulha de aço e,.......
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Discussão
A técnica descrita neste artigo cumpre as necessidades descritas na introdução para otimizar alevinos que são executados para vários fins12. As agulhas descritas aqui reduzem o dano a um nível mínimo, essencialmente não-detectável; a variância com agulhas de vidro (que são propensas a dobrar), agulhas de quartzo são rígidas e certifique-se de um hit confiável da região cerebral desejado mesmo em profundas coordenadas. Além disso, o furo lateral garante entrega da solução, mesmo qu.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho tem sido apoiado por uma subvenção da Comunidade Europeia [projecto FP7-pessoas-2011-IAPP 285827 (EPIXCHANGE)].
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Capilares de quartzo | Sutter Instruments, Novato, CA USA | Q100-50-10 | Sem extrator de filamento |
| Frasco de armazenamento de micropipeta | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, EUA | E210 | |
| Leica Microsystems, Wetzlar, Alemanha | LMD6500 | ||
| Hamilton ILS Innovative Labor Systeme GmbH, StŸ tzerbach, Alemanha | 19138-U | ||
| Bomba de microinfusão | Univentor, Zejtun, Malta | Modelo 864 | |
| Kit de bomba de microinjeção manual | WPI | Item#: Kit MMP-KIT | que permite que as micropipetas sejam montadas com segurança na estrutura estereotáxica |
| Furadeira de Precisão | Proxxon | 28510 MicroMot 50/E | Eixo de acionamento com rolamento de esferas com velocidade variável |
| Artficial Cerebral Fluido espinhal | Tocris | 3525 | |
| Agulhas 26 G sem corte e 30 g Chanfro | Hamilton | 26 G sem corte: 19138-U 30 G Chanfro: 20757 | |
| Micrótomo | Leica, Alemanha | LEICA RM212RT |
Referências
- Kirik, D., Rosenblad, C., Björklund, A. Characterization of behavioral and neurodegenerative changes following partial lesions of the nigrostriatal dopamine system induced by intrastriatal 6-hydroxydopamine in the rat. Exp Neurol. 152 (2), 259-277 (1998).
- Paolone, G., Brugnoli, A., Arcuri, A., Mercatelli, D., Morari, M.
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Reimpressões e permissões
