Personlig pinner for Microinjections i gnager hjernen

Summary

Her beskriver vi en protokoll for microinjection i gnager hjernen som bruker kvarts nåler. Nålene ikke produsere synlig vevsskade og sikre pålitelige leveranser selv i dyp regioner. Videre de kan tilpasses behov av personlig design og kan brukes på nytt.

Abstract

Microinjections har vært brukt i lang tid for levering av narkotika eller giftstoffer i bestemte hjernen områder og, mer nylig de har blitt brukt til å levere genet eller cellen terapi produkter. Dessverre dagens microinjection teknikker bruke stål eller glass nåler som er suboptimal for flere grunner: spesielt stål nåler kan skade vev og glass nåler kan bøye når senket dypt inn i hjernen, mangler målregion. I denne artikkelen beskriver vi en protokoll for å klargjøre og bruke quartz nåler som kombinerer en rekke nyttige funksjoner. Nålene produserer ikke synlig vevsskade, og å være veldig stive, sikre pålitelige leveranser i ønsket hjernen regionen selv når bruker dyp koordinater. Videre er det mulig å tilpasse utformingen av nålen ved å lage flere hull av ønsket diameter. Flere hull lette injeksjon av store mengder løsning i et større område, mens store hull lette injeksjon av celler. I tillegg kan nålene kvarts rengjøres og brukes på nytt, slik at prosedyren blir kostnadseffektiv.

Introduction

Microinjections har blitt brukt i lang tid for levering av farmakologisk aktive forbindelser for å modulere neuronal aktivitet i bestemte hjernen områder. Dessuten, har de blitt brukt til å injisere giftstoffer nær bestemt neuronal befolkninger, å etterligne nevrodegenerative hendelser karakteristisk for visse sykdommer, for eksempel 6-hydroxy-dopamin i nigrostriatal dopamin systemet å etterligne Parkinsons sykdom ^{1 , 2} eller immunotoxin 192 IgG saporin til lesjon cholinergic system³. Nylig har microinjection prosedyrer blitt brukt til å levere viral vektorer eller celler grafts for genet eller cellen terapi eksperimentell hjernen lidelser^4,5.

Klassisk typen nåler i disse studiene er laget av rustfritt stål. Selv om enkel og praktisk å bruke, stål nåler har en rekke problemer⁶: de er relativt stor og kan skade vev, lekkasje av blod – hjerne barrieren og aktivering av astrocyttene; Videre kan de produserer prøvetaking av hjernevev som kommer inn nålen oppretter et hinder eller selv helt unngå flyten av ønsket løsningen. Flere nylig, glass nåler forberedt adhoc fra kapillærene er innført i bruk^7,8. Dette gir betydelige vev skade eller astrocytter aktivisering, men er relativt fleksible og kan bøye når introdusert i dype strukturer, redusere nøyaktigheten av lokalisering (personlige observasjoner).

Det er derfor behov for å redusere så mye som mulig skade (særlig når utføre eksperimenter for å helbrede skaden) samtidig øke nøyaktigheten og reproduserbarhet (dvs., sikre at alle løsning leveres og sikre riktig lokalisering). Dessuten ville det være ønskelig å bruke ulike nålen design for å sikre optimal fordeling av injisert løsningen i hjernen områder med varierende geometri. I denne artikkelen beskriver vi en protokoll for å klargjøre og bruke quartz nåler for microinjections i gnager hjernen. Det høyt smeltepunktet, kvarts kapillærene ikke kan trekkes på en vanlig avtrekker og derfor ikke har vært brukt tidligere for å generere nåler. Kvarts, men tilbyr noen viktige fordeler over glass, spesielt høy stivhet og bryte motstand⁹. På grunn av deres stivhet, er kvarts nåler ideell for injeksjoner i ventrale hjernen regioner. På grunn av deres høy motstand mot brudd kan de modelleres for å inkludere flere hull, skaffe design som kan bli mest effektivt selv når målretting hjernen med komplekse geometrier¹⁰.

Protocol

Alle eksperimentelle protokoller ble godkjent av universitetet av Ferrara etiske komiteen for dyr eksperimentering og italiensk Helsedepartementet. ANKOMME (dyr forskning: rapportering i Vivo eksperimenter11) retningslinjer er fulgt. 1. forberedelse av kvarts nåler Rengjøres og steriliseres kvarts kapillærene (se Tabell for materiale) ved å plassere dem for 5 min med destillert vann, 5 min i etanol 99% og 5 minutter i diethyl-Eter. <…

Representative Results

Vi sammenlignet skade forårsaket av direkte microinjection i rotte dorsal hippocampus og striatum bruker en kvarts nål (60 µM ytre diameter tips, en 20 µM diameter siden hull, type C, figur 1) sammenlignet med to classic, 26 G sløv slutten og 30 G skråkant kanten rustfritt stål nåler. Til dette målet, vi injisert 2 µL av aCSF til høyre og venstre dorsal hippocampus og striatum med henholdsvis av kvarts og stål nål og, 48 timer etter injeksjon, vi…

Discussion

Teknikken er beskrevet i denne artikkelen oppfyller behovene i innføring for å optimalisere microinjections som utføres for ulike formål¹². Nålene beskrevet her redusere skadene til et minimum, i hovedsak ikke-detectable nivå; avvik med glass nåler (som er utsatt for bøye), kvarts nåler er stive og sikre en pålitelig rammet av ønsket hjernen regionen i dyp koordinater. Videre sikrer siden hullet levering av løsningen selv om tips hullet blir okkludert under innsetting …

Materials

Quartz capillaries	Sutter Instruments, Novato, CA USA	Q100-50-10	Without filament
Puller	Sutter	P2000
Micropipette storage jar	World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA	E210
Laser microdissector	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	LMD6500
Hamilton syringe	Hamilton ILS Innovative Labor Systeme GmbH, StŸtzerbach, Germany	19138-U
Microinfusion pump	Univentor, Zejtun, Malta	Model 864
Manual microinjection pump kit	WPI	Item#: MMP-KIT	Kit allowing for micropipettes to be securely mounted to the stereotactic frame
Precision Drill	Proxxon	28510 MicroMot 50/E	Ball bearing drive shaft with variable speed
Artficial Cerebral Spinal Fluid	Tocris	3525
Needles 26 G Blunt and 30 G Bevel	Hamilton	26 G Blunt: 19138-U 30 G Bevel: 20757
Microtome	Leica, Germany	LEICA RM212RT