Isolamento delle cellule della ganglioma della retina primaria (RGC) mediante citometria a flusso
Summary
Milioni di persone soffrono di malattie degenerative della retina che provocano cecità irreversibile. Un elemento comune di molte di queste malattie è la perdita delle cellule del ganglio retinico (RGC). Questo protocollo dettagliato descrive l'isolamento di RGC murine primari mediante selezione positiva e negativa con citometria a flusso.
Abstract
Le malattie neurodegenerative spesso hanno un impatto devastante su coloro che sono colpiti. La perdita di cellule della ganglioma retinica (RGC) è implicata in una serie di malattie, tra cui la retinopatia diabetica e il glaucoma, oltre al normale invecchiamento. Nonostante la loro importanza, i RGCs sono stati estremamente difficili da studiare finora, in parte a causa del fatto che essi comprendono solo una piccola percentuale della grande varietà di cellule della retina. Inoltre, i metodi di isolamento attuali utilizzano marcatori intracellulari per identificare RGC, che producono cellule non vitali. Queste tecniche coinvolgono anche lunghi protocolli di isolamento, per cui esiste una mancanza di metodi pratici, standardizzati e affidabili per ottenere e isolare i RGC. Questo lavoro descrive un metodo efficiente, completo e affidabile per isolare i RGC primari dalla retina dei topi usando un protocollo basato sui criteri di selezione sia positivi che negativi. I metodi presentati consentono il futuro studio dei RGC, con l'obiettivo di una migliore comprensione dei principaliDiminuzione dell'acuità visiva che risulta dalla perdita di RGC funzionali nelle malattie neurodegenerative.
Introduction
I RGC sono terminali differenziati dai neuroni e pertanto sono necessarie le cellule primarie per la sperimentazione. Lo sviluppo di un protocollo per l'isolamento e l'arricchimento delle cellule primarie di ghiandole retiniche murine (RGCs) è fondamentale per rivelare i meccanismi di salute e degenerazione di RGC in vitro . Ciò è particolarmente importante per studi che cercano di generare potenziali terapie per promuovere la funzione RGC e per ridurre al minimo la loro morte. La degenerazione dei RGC è associata a malattie degenerative della retina, come il glaucoma, la retinopatia diabetica e l'invecchiamento normale. Anche se i meccanismi cellulari specifici alla base della perdita di RGC non sono chiari, sono stati individuati una serie di fattori di rischio. La mancanza di ossigenazione alla testa del nervo ottico 1 , 2 , 3 provoca la morte di RGC 4 e funge da disturbo dell'omeostasi tra l'attivazione di eccitatori e iRecettori nhibitory all'interno di singoli RGCs 5 , 6 . Una serie di sfide impediscono il progresso verso l'uso di queste cellule per studi approfonditi. In primo luogo, il numero di RGC presenti in una retina murina è piccolo. RGC rappresentano meno dell'1% delle cellule retiniche totali 7 , 8 , 9 . Secondo, la maggior parte dei marker RGC-specifici sono proteine intracellulari 10 , 11 , 12 . La selezione basata su questi marcatori lascia le cellule inattive, che esclude le analisi funzionali a valle. Infine, i protocolli attualmente disponibili sono lunghi e mancano la standardizzazione 13 , 14 . I primi protocolli di isolamento RGC sono stati basati su metodi di immunopanning. Barres et al. 15 Adattato il classico immunoplayAnnotando la tecnica e ha aggiunto un secondo passo, che escludeva monociti e cellule endoteliali dalla maggior parte delle cellule retiniche prima della selezione positiva basata sull'immunopositività all'antigene anti-timocitico (aka Thy1), un marker di superficie cellulare. Anni dopo, Hong et al. Tecniche di isolamento del tallone magnetico combinato con strategie di selezione delle cellule per isolare RGC con purezza superiore 16 . L'uso di perline magnetiche è ancora utilizzato in molte applicazioni scientifiche. Insieme, i branelli magnetici ei protocolli di citometria di flusso hanno migliorato la purezza delle cellule isolate. Tuttavia, questi sistemi di purificazione non sono ancora stati standardizzati per l'isolamento dei RGC murini da retina dissociata.
La citometria di flusso è un potente metodo analitico che misura le caratteristiche ottiche e fluorescenti delle sospensioni cellulari. Le cellule sono analizzate in modo quantitativo e qualitativo con un elevato livello di sensibilità, fornendo un'analisi multidimensionale del populino cellularezione. La discriminazione cellulare si basa su due principali proprietà fisiche: dimensione delle cellule o superficie e granularità o complessità interna 17 . È possibile eseguire un'analisi multidimensionale combinando anticorpi tagliati con fluorochromi che presentano lunghezze d'onda simili e diverse emissioni. La citometria del flusso è veloce, riproducibile e sensibile. I laser Multitpe permettono di analisi multidimensionali ancora più grandi di singole cellule mediante citometria a flusso. Quindi è una metodologia attraente per lo studio di campioni citologici. La classificazione delle cellule attivata con fluorescenza (FACS) utilizza le differenze fenotipiche multidimensionali identificate dalla citometria di flusso per ordinare singole cellule in sottopopolazioni distinte.
Nell'ultimo decennio, proteine multiple e proteine intracellulari sono state identificate come potenziali biomarcatori per la selezione delle cellule, compresi i neuroni. Gli studi iniziali che cercavano di isolare i RGC dai topi utilizzavano Thy1 come un ganglio celL marker. Purtroppo, Thy1, aka CD90, ha diverse isoforme in altre specie di roditore 18 , 19 e 20 ed è espresso da più tipi di cellule retiniche 19 , 20 , rendendolo un marker non specifico per i RGC. Un altro marcatore di superficie, CD48, si trova sulle popolazioni monocitiche nella retina, tra cui macrofagi e microglia. Usando questi due marcatori di superficie, una delle cellule negate di RGC firmate Thy1 + e CD48 è stata sviluppata 15 , 16 , 21 , 22 . Purtroppo, questi due criteri di selezione non sono sufficienti per selezionare una popolazione RGC altamente arricchita. Per affrontare questa necessità non soddisfatta, è stato sviluppato un protocollo di citometria di flusso 23 basato su criteri di selezione positivi e negativi multi-layer usiI marker di superficie delle cellule noti per arricchire e purificare RGC murine primarie.
Protocol
Representative Results
Discussion
FACS è la tecnica di scelta per purificare le popolazioni cellulari. Altri metodi di isolamento includono immunopanning, perline magnetiche e depletionamento della fissazione del complemento. Il vantaggio di FACS rispetto a queste altre metodologie si basa sull'identificazione simultanea di marcatori a superficie cellulare con gradi di intensità variabili. L'intensità fluorescente della molecola è proporzionale alla quantità di espressione proteica. Fino ad ora l'isolamento dei RGC è basato esclusivame…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori vorrebbero ringraziare il Sig. Tim Higgins, Senior Illustrator del Dipartimento di Microbiologia, Immunologia e Biochimica, per l'assistenza tecnica video; Il dottor Matthew W. Wilson per le discussioni ei membri dei laboratori Jablonski e Morales-Tirado per i loro commenti utili. Questo lavoro è stato sostenuto dall'Istituto di Ricerca Giovani Investigatori dell'Istituto di Ricerca di Alcon (VMM-T), dall'Università della Tennessee Research Foundation (VMM-T), dall'Istituto Nazionale di Occhi EY021200 (MMJ), dalla Gerwin Fellowship (VMM-T); La borsa di studio pre-dottorale di Gerwin (ZKG), la ricerca medica dell'esercito della difesa e il comando dei materiali (VMM-T) e la sovvenzione senza restrizioni dalla ricerca per prevenire la cecità.
Materials
| Anti-mouse CD15 PE | BioLegend | 125606 | Clone MC-480 |
| Anti-mouse CD48 PE-Cy7 | BioLegend | 103424 | Clone HM48-1 |
| Anti-mouse CD57 | Sigma Aldrich | C6680-100TST | Clone VC1.1 |
| Anti-mouse CD90.2 AF700 | BioLegend | 105320 | Clone 30-H12 |
| Brilliant Violet 421 Goat Anti-mouse IgG | BioLegend | 405317 | Clone Poly4053 |
| Purified Anti-mouse CD16/32 | BioLegend | 101302 | FcgRII/III block, Clone 93 |
| Zombie Aqua | BioLegend | 423102 | Live cell/ Dead cell discrimination |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30071.03 | U.S. origin |
| AbC Total Antibody Compensation Bead Kit | Thermo Fisher Scientific | A10497 | Multi-species Ig |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | Add serum to media prior to culture. |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | Saline solution |
| Dissection Microscope | Olympus | SZ-PT Model | Stereo Microscope |
| Sorvall Centrifuge | Thermo Scientific | ST 16R | All centrifugation performed at RT |
| Base Plate – Dissection Pan | Fisher Scientific | SB15233FIM | A wax plate can also be used |
| Forceps | Aesculap | 5002-7 | 4 ½ inches |
| Iris Scissors, Straight | Aesculap | 1360 | 5 ½ inches |
| Falcon 15 mL conical tubes | Fisher Scientific | 352097 | Polypropylene tubes |
| Falcon 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 352098 | Polypropylene tubes |
| BD FACS Tubes | Fisher Scientific | 352003 | Polypropylene tubes |
| 40 mm dishes | MidSci | TP93040 | Tissue culture treated |
| 70 μm nylon strainer | MidSci | 70ICS | sterile |
| 40 μm nylon strainer | MidSci | 40ICS | sterile |
| BD 10 mL syringe | Fisher Scientific | 301604 | Disposable Syringe without needle |
| Pestles | MidSci | PEST | sterile |
| Wheaton Vials | Fisher Scientific | 986734 | No Liner |
| BD 30 G needle | Fisher Scientific | 305128 | 1 inch |
| Hausser Scientific Bright-Line Glass Counting Chamber | Fisher Scientific | 0267151B | Hemocytometer |
| Gibco Trypan blue 0.4% Solution | Fisher Scientific | 15250061 | Viability Dye |
| Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 05-402-25 | 1.5mL |
| EVOS Floid Cell Imaging | Thermo Fisher Scientific | 447113 | Fluorescence Imaging with a 20x objective |
| 100% Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-452 | Used to make 70% Ethanol |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ | Rainin | 17014282 | LTS Pipette |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+ | Rainin | 17014391 | LTS Pipette |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+ | Rainin | 17014392 | LTS Pipette |
| Rack LTS 1000 mL – GPS-L1000S | Rainin | 17005088 | Blue Rack Sterile Tips |
| Rack LTS 250 mL – GPS-L250S | Rainin | 17005092 | Green Rack Sterile Tips |
| Rack LTS 20 mL – GPS-L10S | Rainin | 17005090 | Red Rack Sterile Tips |
| FACSAria II Cell Sorter | BD Biosciences | N/A | Custom order |
| LSR II Cytometer | BD Biosciences | N/A | Custom order |
| Abca8a | Thermo Fisher Scientific | Mm00462440_m1 | Müller cells |
| Aldh1al | Thermo Fisher Scientific | Mm00657317_m1 | Müller cells |
| Aqp4 | Thermo Fisher Scientific | Mm00802131_m1 | Astrocytes |
| Calb2 | Thermo Fisher Scientific | Mm00801461_m1 | Amacrine, Horizontal |
| Cd68 | Thermo Fisher Scientific | Mm03047340_m1 | Retinal Pigment Epithelial Cells |
| Gad2 | Thermo Fisher Scientific | Mm00484623_m1 | Amacrine |
| Hprt | Thermo Fisher Scientific | Mm01545399_m1 | House keeping gene |
| Lhx1 | Thermo Fisher Scientific | Mm01297482_m1 | Horizontal |
| Lim2 | Thermo Fisher Scientific | Mm00624623_m1 | Horizontal |
| Nrl | Thermo Fisher Scientific | Mm00476550_m1 | Photoreceptors |
| Ntrk1 | Thermo Fisher Scientific | Mm01219406_m1 | Horizontal |
| Pcp4 | Thermo Fisher Scientific | Mm00500973_m1 | Bipolar, Amacrine |
| Pou4f1 | Thermo Fisher Scientific | Mm02343791_m1 | Retinal Ganglion Cells |
| Prdx6 | Thermo Fisher Scientific | Mm00725435_s1 | Astrocytes |
| Prkca | Thermo Fisher Scientific | Mm00440858_m1 | Bipolar |
| Prox1 | Thermo Fisher Scientific | Mm00435969_m1 | Horizontal |
| Pvalb | Thermo Fisher Scientific | Mm00443100_m1 | Amacrine |
| Rbpms | Thermo Fisher Scientific | Mm02343791_m1 | Retinal Ganglion Cells |
| Rom1 | Thermo Fisher Scientific | Mm00436364_g1 | Photoreceptors |
| Rpe65 | Thermo Fisher Scientific | Mm00504133_m1 | Retinal Pigment Epithelial cells |
| Slc1a3 | Thermo Fisher Scientific | Mm00600697_m1 | Astrocytes |
| Slc6a9 | Thermo Fisher Scientific | Mm00433662_m1 | Amacrine |
| Sncg | Thermo Fisher Scientific | Mm00488345_m1 | Retinal Ganglion Cells |
| Tubb3 | Thermo Fisher Scientific | Mm00727586_s1 | Retinal Ganglion Cells |
| Vim | Thermo Fisher Scientific | Mm01333430_m1 | Müller cells |
| Taqman Universal Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4440047 | qPCR Reagent |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | RNA Isolation |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | 11754250 | cDNA synthesis |
| Taqman PreAmp Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4391128 | Pre-Amplification step |
| BD Cytofix/ Cytoperm | BD Biosciences | 554714 | Fixation/ Permeabilization Buffer |
| BD Perm/ Wash | BD Biosciences | 554723 | Permeabilization Solution |
| RBPMS | Santa Cruz Biotechnology | sc-86815 | intracellular antibody |
| SNCG | Gene Tex | GTX110483 | intracellular antibody |
| BRN3A | Santa Cruz Biotechnology | sc-8429 | intracellular antibody |
| TUJ1 | BioLegend | 801202 | intracellular antibody |
Referências
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