Isolering av primære murin retinale Ganglion-celler (RGCer) ved Flow Cytometry
Summary
Millioner mennesker lider av retinal degenerative sykdommer som resulterer i irreversibel blindhet. Et vanlig element i mange av disse sykdommene er tap av retinal ganglion celler (RGCs). Denne detaljerte protokollen beskriver isoleringen av primære murine RGCs ved positivt og negativt utvalg med strømningscytometri.
Abstract
Neurodegenerative sykdommer har ofte en ødeleggende effekt på de berørte. Retinal ganglioncelle (RGC) tap er implicert i en rekke sykdommer, inkludert diabetisk retinopati og glaukom, i tillegg til normal aldring. Til tross for deres betydning har RGCs vært ekstremt vanskelig å studere til nå, delvis på grunn av at de bare utgjør en liten prosentandel av det store antallet celler i netthinnen. I tillegg bruker nåværende isolasjonsmetoder intracellulære markører for å identifisere RGC, som produserer ikke-levedyktige celler. Disse teknikkene innebærer også lange isolasjonsprotokoller, så det er mangel på praktiske, standardiserte og pålitelige metoder for å oppnå og isolere RGCer. Dette arbeidet beskriver en effektiv, omfattende og pålitelig metode for å isolere primære RGCer fra mus retinae ved hjelp av en protokoll basert på både positive og negative utvalgskriterier. De fremlagte metodene tillater den fremtidige studien av RGCs, med målet om å bedre forstå majorenNedgang i synsskarphet som skyldes tap av funksjonelle RGC i neurodegenerative sykdommer.
Introduction
RGC er terminalt differensierte nevroner, og derfor er primære celler kreves for eksperimentering. Utviklingen av en protokoll for isolering og anrikning av primære murine retinale ganglionceller (RGC) er avgjørende for å avsløre mekanismer for RGC helse og degenerasjon in vitro . Dette er spesielt viktig for studier som søker å generere potensielle terapier for å fremme RGC-funksjonen og for å minimere deres død. Degenerasjonen av RGC er forbundet med retinal degenerative sykdommer, slik som glaukom, diabetisk retinopati og normal aldring. Selv om de spesifikke cellemekanismer som ligger til grund for RGC-tap er uklare, er det identifisert en rekke risikofaktorer. Mangel på oksygenering i optisk nervehodet 1 , 2 , 3 forårsaker RGC død 4 og virker som forstyrrelsen av homeostasen mellom aktiveringen av excitatoriske og jegInhibitorer innen individuelle RGC 5 , 6 . En rekke utfordringer hindrer fremgang i retning av bruk av disse cellene for dybdegående studier. For det første er antall RGC som er tilstede i en murin retina liten. RGCer utgjør mindre enn 1% av de totale retinale cellene 7 , 8 , 9 . For det andre er de fleste RGC-spesifikke markører intracellulære proteiner 10 , 11 , 12 . Utvalg basert på disse markørene etterlater cellene ikke-levedyktig, noe som utelukker nedstrømsfunksjonelle analyser. Til slutt er tilgjengelige protokoller lange og mangler standardisering 13 , 14 . Tidlige RGC-isolasjonsprotokoller ble basert på immunopaneringsmetoder. Barres et al. 15 Tilpasset den klassiske immunopløsningenAnningsteknikk og tilsatt et annet trinn, som ekskluderte monocytter og endotelceller fra hovedparten av retinale celler før positiv seleksjon basert på immunopositivitet mot anti-tymocytt antigen (aka Thy1), en celleoverflate-markør. År senere, Hong et al. Kombinert magnetisk vulst isolasjon teknikker med celle sortering strategier for å isolere RGCs med høyere renhet 16 . Bruken av magnetiske perler brukes fortsatt i mange vitenskapelige applikasjoner. Sammen forbedret magnetiske kuler og flytcytometriprotokoller renheten til isolerte celler. Imidlertid har disse rensningssystemene ennå ikke blitt standardisert for isolering av murine RGCer fra dissocierte retinae.
Flowcytometri er en kraftig analysemetode som måler optiske og fluorescensegenskaper ved cellesuspensjon. Celler analyseres både kvantitativt og kvalitativt med høy følsomhetsgrad, og gir en flerdimensjonal analyse av cellepopulasjonenasjon. Cellediskriminering er basert på to hoved fysiske egenskaper: celle størrelse eller overflateareal og granularitet eller intern kompleksitet 17 . En flerdimensjonal analyse kan utføres ved å kombinere antistoffer merket med fluorokrom som har lignende eksitasjonsbølgelengder og forskjellige utslipp. Flowcytometri er rask, reproduserbar og sensitiv. Multitep lasere tillater enda større flerdimensjonale analyser av enkeltceller ved hjelp av flytcytometri. Dermed er det en attraktiv metodikk for studier av cytologiske prøver. Fluorescensaktivert cellesortering (FACS) bruker de multidimensjonale fenotypiske forskjellene identifisert ved hjelp av flytcytometri for å sortere individuelle celler i forskjellige subpopulasjoner.
I det siste tiåret har flere overflate- og intracellulære proteiner blitt identifisert som potensielle biomarkører for seleksjon av celler, inkludert nevroner. Første studier som forsøkte å isolere RGCer fra rotter brukte Thy1 som en ganglioncelleL markør. Dessverre har Thy1, aka CD90, flere isoformer i andre gnaverarter 18 , 19 , 20 og uttrykkes av flere retinale celletyper 19 , 20 , noe som gjør den til en ikke-spesifikk markør for RGC'er. En annen overflate markør, CD48, er funnet på monocytiske populasjoner i netthinnen, inkludert makrofager og microglia. Ved å bruke disse to overflate markørene ble en modifisert RGC signatur-Thy1 + og CD48 negceller utviklet 15 , 16 , 21 , 22 . Dessverre er disse to utvalgskriteriene ikke tilstrekkelig til å velge for en svært beriket RGC-befolkning. For å løse dette uoppløste behovet ble en flyt-cytometriprotokoll utviklet 23 basert på flere lag positive og negative utvalgskriterier usiNg kjente celleoverflate markører for å berike og rense primære murine RGCs.
Protocol
Representative Results
Discussion
FACS er den valgte teknikken for å rense cellepopulasjoner. Andre isolasjonsmetoder inkluderer immunopanning, magnetiske perler og komplementfiksjonsdepletjon. Fordelen med FACS over disse andre metoder er basert på samtidig identifisering av celleoverflate markører med varierende intensitetsnivåer. Den fluorescerende intensiteten til molekylet er proporsjonal med mengden proteinuttrykk. Inntil nå var isoleringen av RGC basert utelukkende på Thy1 (CD90) positivitet og CD48 negativitet 15 <s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gjerne takke hr. Tim Higgins, senior illustrator fra Institutt for mikrobiologi, immunologi og biokjemi, for teknisk videohjelp; Dr. Matthew W. Wilson for diskusjoner og medlemmene av laboratoriene Jablonski og Morales-Tirado for deres nyttige kommentarer. Dette arbeidet ble støttet av Alcon Research Institute Young Investigator Award (VMM-T), University of Tennessee Research Foundation (VMM-T), National Eye Institute EY021200 (MMJ), Gerwin Fellowship (VMM-T); Gerwin Pre-doctoral fellowship (ZKG), Institutt for forsvarshærens medisinsk forskning og materiellkommando (VMM-T), og ubegrenset tilskudd fra forskning for å forhindre blindhet.
Materials
| Anti-mouse CD15 PE | BioLegend | 125606 | Clone MC-480 |
| Anti-mouse CD48 PE-Cy7 | BioLegend | 103424 | Clone HM48-1 |
| Anti-mouse CD57 | Sigma Aldrich | C6680-100TST | Clone VC1.1 |
| Anti-mouse CD90.2 AF700 | BioLegend | 105320 | Clone 30-H12 |
| Brilliant Violet 421 Goat Anti-mouse IgG | BioLegend | 405317 | Clone Poly4053 |
| Purified Anti-mouse CD16/32 | BioLegend | 101302 | FcgRII/III block, Clone 93 |
| Zombie Aqua | BioLegend | 423102 | Live cell/ Dead cell discrimination |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30071.03 | U.S. origin |
| AbC Total Antibody Compensation Bead Kit | Thermo Fisher Scientific | A10497 | Multi-species Ig |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | Add serum to media prior to culture. |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | Saline solution |
| Dissection Microscope | Olympus | SZ-PT Model | Stereo Microscope |
| Sorvall Centrifuge | Thermo Scientific | ST 16R | All centrifugation performed at RT |
| Base Plate – Dissection Pan | Fisher Scientific | SB15233FIM | A wax plate can also be used |
| Forceps | Aesculap | 5002-7 | 4 ½ inches |
| Iris Scissors, Straight | Aesculap | 1360 | 5 ½ inches |
| Falcon 15 mL conical tubes | Fisher Scientific | 352097 | Polypropylene tubes |
| Falcon 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 352098 | Polypropylene tubes |
| BD FACS Tubes | Fisher Scientific | 352003 | Polypropylene tubes |
| 40 mm dishes | MidSci | TP93040 | Tissue culture treated |
| 70 μm nylon strainer | MidSci | 70ICS | sterile |
| 40 μm nylon strainer | MidSci | 40ICS | sterile |
| BD 10 mL syringe | Fisher Scientific | 301604 | Disposable Syringe without needle |
| Pestles | MidSci | PEST | sterile |
| Wheaton Vials | Fisher Scientific | 986734 | No Liner |
| BD 30 G needle | Fisher Scientific | 305128 | 1 inch |
| Hausser Scientific Bright-Line Glass Counting Chamber | Fisher Scientific | 0267151B | Hemocytometer |
| Gibco Trypan blue 0.4% Solution | Fisher Scientific | 15250061 | Viability Dye |
| Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 05-402-25 | 1.5mL |
| EVOS Floid Cell Imaging | Thermo Fisher Scientific | 447113 | Fluorescence Imaging with a 20x objective |
| 100% Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-452 | Used to make 70% Ethanol |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ | Rainin | 17014282 | LTS Pipette |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+ | Rainin | 17014391 | LTS Pipette |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+ | Rainin | 17014392 | LTS Pipette |
| Rack LTS 1000 mL – GPS-L1000S | Rainin | 17005088 | Blue Rack Sterile Tips |
| Rack LTS 250 mL – GPS-L250S | Rainin | 17005092 | Green Rack Sterile Tips |
| Rack LTS 20 mL – GPS-L10S | Rainin | 17005090 | Red Rack Sterile Tips |
| FACSAria II Cell Sorter | BD Biosciences | N/A | Custom order |
| LSR II Cytometer | BD Biosciences | N/A | Custom order |
| Abca8a | Thermo Fisher Scientific | Mm00462440_m1 | Müller cells |
| Aldh1al | Thermo Fisher Scientific | Mm00657317_m1 | Müller cells |
| Aqp4 | Thermo Fisher Scientific | Mm00802131_m1 | Astrocytes |
| Calb2 | Thermo Fisher Scientific | Mm00801461_m1 | Amacrine, Horizontal |
| Cd68 | Thermo Fisher Scientific | Mm03047340_m1 | Retinal Pigment Epithelial Cells |
| Gad2 | Thermo Fisher Scientific | Mm00484623_m1 | Amacrine |
| Hprt | Thermo Fisher Scientific | Mm01545399_m1 | House keeping gene |
| Lhx1 | Thermo Fisher Scientific | Mm01297482_m1 | Horizontal |
| Lim2 | Thermo Fisher Scientific | Mm00624623_m1 | Horizontal |
| Nrl | Thermo Fisher Scientific | Mm00476550_m1 | Photoreceptors |
| Ntrk1 | Thermo Fisher Scientific | Mm01219406_m1 | Horizontal |
| Pcp4 | Thermo Fisher Scientific | Mm00500973_m1 | Bipolar, Amacrine |
| Pou4f1 | Thermo Fisher Scientific | Mm02343791_m1 | Retinal Ganglion Cells |
| Prdx6 | Thermo Fisher Scientific | Mm00725435_s1 | Astrocytes |
| Prkca | Thermo Fisher Scientific | Mm00440858_m1 | Bipolar |
| Prox1 | Thermo Fisher Scientific | Mm00435969_m1 | Horizontal |
| Pvalb | Thermo Fisher Scientific | Mm00443100_m1 | Amacrine |
| Rbpms | Thermo Fisher Scientific | Mm02343791_m1 | Retinal Ganglion Cells |
| Rom1 | Thermo Fisher Scientific | Mm00436364_g1 | Photoreceptors |
| Rpe65 | Thermo Fisher Scientific | Mm00504133_m1 | Retinal Pigment Epithelial cells |
| Slc1a3 | Thermo Fisher Scientific | Mm00600697_m1 | Astrocytes |
| Slc6a9 | Thermo Fisher Scientific | Mm00433662_m1 | Amacrine |
| Sncg | Thermo Fisher Scientific | Mm00488345_m1 | Retinal Ganglion Cells |
| Tubb3 | Thermo Fisher Scientific | Mm00727586_s1 | Retinal Ganglion Cells |
| Vim | Thermo Fisher Scientific | Mm01333430_m1 | Müller cells |
| Taqman Universal Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4440047 | qPCR Reagent |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | RNA Isolation |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | 11754250 | cDNA synthesis |
| Taqman PreAmp Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4391128 | Pre-Amplification step |
| BD Cytofix/ Cytoperm | BD Biosciences | 554714 | Fixation/ Permeabilization Buffer |
| BD Perm/ Wash | BD Biosciences | 554723 | Permeabilization Solution |
| RBPMS | Santa Cruz Biotechnology | sc-86815 | intracellular antibody |
| SNCG | Gene Tex | GTX110483 | intracellular antibody |
| BRN3A | Santa Cruz Biotechnology | sc-8429 | intracellular antibody |
| TUJ1 | BioLegend | 801202 | intracellular antibody |
Referências
- Flammer, J., Orgul, S. Optic nerve blood-flow abnormalities in glaucoma. Prog Retin Eye Res. 17 (2), 267-289 (1998).
- Bathija, R. Optic nerve blood flow in glaucoma. Clin Exp Optom. 83 (3), 180-184 (2000).
- Osborne, N. N., Melena, J., Chidlow, G., Wood, J. P. A hypothesis to explain ganglion cell death caused by vascular insults at the optic nerve head: possible implication for the treatment of glaucoma. Br J Ophthalmol. 85 (10), 1252-1259 (2001).
- Morgan, J. E. Circulation and axonal transport in the optic nerve. Eye (Lond). 18 (11), 1089-1095 (2004).
- Tian, N., Hwang, T. N., Copenhagen, D. R. Analysis of excitatory and inhibitory spontaneous synaptic activity in mouse retinal ganglion cells. J Neurophysiol. 80 (3), 1327-1340 (1998).
- Schmidt, K. G., Bergert, H., Funk, R. H. Neurodegenerative diseases of the retina and potential for protection and recovery. Curr Neuropharmacol. 6 (2), 164-178 (2008).
- Dreher, B., Sefton, A. J., Ni, S. Y., Nisbett, G. The morphology, number, distribution and central projections of Class I retinal ganglion cells in albino and hooded rats. Brain Behav Evol. 26 (1), 10-48 (1985).
- Williams, R. W., Strom, R. C., Rice, D. S., Goldowitz, D. Genetic and environmental control of variation in retinal ganglion cell number in mice. J Neurosci. 16 (22), 7193-7205 (1996).
- Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. The major cell populations of the mouse retina. J Neurosci. 18 (21), 8936-8946 (1998).
- Surgucheva, I., Weisman, A. D., Goldberg, J. L., Shnyra, A., Surguchov, A. Gamma-synuclein as a marker of retinal ganglion cells. Mol Vis. 14, 1540-1548 (2008).
- Nadal-Nicolas, F. M., et al. Brn3a as a marker of retinal ganglion cells: qualitative and quantitative time course studies in naive and optic nerve-injured retinas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (8), 3860-3868 (2009).
- Kwong, J. M., Caprioli, J., Piri, N. RNA binding protein with multiple splicing: a new marker for retinal ganglion cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (2), 1052-1058 (2010).
- Van Bergen, N. J., et al. Recharacterization of the RGC-5 retinal ganglion cell line. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (9), 4267-4272 (2009).
- Wood, J. P., Chidlow, G., Tran, T., Crowston, J. G., Casson, R. J. A comparison of differentiation protocols for RGC-5 cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (7), 3774-3783 (2010).
- Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning. Neuron. 1 (9), 791-803 (1998).
- Hong, S., Iizuka, Y., Kim, C. Y., Seong, G. J. Isolation of primary mouse retinal ganglion cells using immunopanning-magnetic separation. Mol Vis. 18, 2922-2930 (2012).
- Julius, R. S. The sensitivity of exponentials and other curves to their parameters. Comput Biomed Res. 5 (5), 473-478 (1972).
- Reif, A. E., Allen, J. M. The Akr Thymic Antigen and Its Distribution in Leukemias and Nervous Tissues. J Exp Med. 120, 413-433 (1964).
- Watanabe, M., Noguchi, T., Tsukada, Y. Regional, cellular, and subcellular distribution of Thy-1 antigen in rat nervous tissues. Neurochem Res. 6 (5), 507-519 (1981).
- Haeryfar, S. M., Hoskin, D. W. Thy-1: more than a mouse pan-T cell marker. J Immunol. 173 (6), 3581-3588 (2004).
- Sahagun, G., Moore, S. A., Fabry, Z., Schelper, R. L., Hart, M. N. Purification of murine endothelial cell cultures by flow cytometry using fluorescein-labeled griffonia simplicifolia agglutinin. Am J Pathol. 134 (6), 1227-1232 (1989).
- Shoge, K., et al. Rat retinal ganglion cells culture enriched with the magnetic cell sorter. Neurosci Lett. 259 (2), 111-114 (1999).
- Chintalapudi, S. R., et al. Isolation and Molecular Profiling of Primary Mouse Retinal Ganglion Cells: Comparison of Phenotypes from Healthy and Glaucomatous Retinas. Front Aging Neurosci. 8, 93 (2016).
- Nagdeve, N. G., Yaddanapudi, S., Pandav, S. S. The effect of different doses of ketamine on intraocular pressure in anesthetized children. J Pediatr Ophthalmol Strabismus. 43 (4), 219-223 (2006).
- Ding, C., Wang, P., Tian, N. Effect of general anesthetics on IOP in elevated IOP mouse model. Exp Eye Res. 92 (6), 512-520 (2011).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nat Protoc. 3 (6), 1101-1108 (2008).
- Aerts, J., Nys, J., Arckens, L. A highly reproducible and straightforward method to perform in vivo ocular enucleation in the mouse after eye opening. J Vis Exp. (92), e51936 (2014).
- Li, X., et al. Loss of AP-2delta reduces retinal ganglion cell numbers and axonal projections to the superior colliculus. Mol Brain. 9 (1), 62 (2016).
- Moshiri, A., et al. Near complete loss of retinal ganglion cells in the math5/brn3b double knockout elicits severe reductions of other cell types during retinal development. Dev Biol. 316 (2), 214-227 (2008).
- Danias, J., et al. Quantitative analysis of retinal ganglion cell (RGC) loss in aging DBA/2NNia glaucomatous mice: comparison with RGC loss in aging C57/BL6 mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (12), 5151-5162 (2003).
- Jakobs, T. C., Ben, Y., Masland, R. H. CD15 immunoreactive amacrine cells in the mouse retina. J Comp Neurol. 465 (3), 361-371 (2003).
- Uusitalo, M., Schlotzer-Schrehardt, U., Kivela, T. Ultrastructural localization of the HNK-1 carbohydrate epitope to glial and neuronal cells of the human retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (3), 961-964 (2003).
- Jackson, C. J., Garbett, P. K., Nissen, B., Schrieber, L. Binding of human endothelium to Ulex europaeus I-coated Dynabeads: application to the isolation of microvascular endothelium. J Cell Sci. 96 ( Pt 2), 257-262 (1990).
- Pennartz, S., Perraut, M., Pfrieger, F. Purification of retinal ganglion cells from postnatal rats by magnetic cell sorting. MACSmore. 12 (2), 16-18 (2010).
- Nadal-Nicolas, F. M., et al. Displaced retinal ganglion cells in albino and pigmented rats. Front Neuroanat. 8, 99 (2014).
- Nadal-Nicolas, F. M., Salinas-Navarro, M., Vidal-Sanz, M., Agudo-Barriuso, M. Two methods to trace retinal ganglion cells with fluorogold: from the intact optic nerve or by stereotactic injection into the optic tract. Exp Eye Res. 131, 12-19 (2015).
- Barnstable, C. J., Drager, U. C. Thy-1 antigen: a ganglion cell specific marker in rodent retina. Neurociência. 11 (4), 847-855 (1984).
- Chiu, K., Lau, W. M., Yeung, S. C., Chang, R. C., So, K. F. Retrograde labeling of retinal ganglion cells by application of fluoro-gold on the surface of superior colliculus. J Vis Exp. (16), (2008).
