Aislamiento de células primarias de ganglio retiniano murino (RGC) por citometría de flujo
Summary
Millones de personas sufren de enfermedades degenerativas retinianas que resultan en ceguera irreversible. Un elemento común de muchas de estas enfermedades es la pérdida de células ganglionares de la retina (RGCs). Este protocolo detallado describe el aislamiento de los RGC murinos primarios mediante selección positiva y negativa con citometría de flujo.
Abstract
Las enfermedades neurodegenerativas a menudo tienen un impacto devastador en los afectados. La pérdida de células ganglionares de la retina (RGC) está implicada en una serie de enfermedades, incluyendo retinopatía diabética y glaucoma, además del envejecimiento normal. A pesar de su importancia, RGCs han sido extremadamente difíciles de estudiar hasta ahora debido en parte al hecho de que comprenden sólo un pequeño porcentaje de la gran variedad de células en la retina. Además, los métodos actuales de aislamiento utilizan marcadores intracelulares para identificar RGC, que producen células no viables. Estas técnicas también implican largos protocolos de aislamiento, por lo que hay una falta de métodos prácticos, estandarizados y confiables para obtener y aislar los RGC. Este trabajo describe un método eficiente, completo y confiable para aislar RGC primaria de ratones retinae utilizando un protocolo basado en ambos criterios de selección positivos y negativos. Los métodos presentados permiten el estudio futuro de los CGR, con el objetivo de comprender mejor lasDisminución de la agudeza visual que resulta de la pérdida de RGC funcional en las enfermedades neurodegenerativas.
Introduction
Los RGC son neuronas diferenciadas terminalmente, y por lo tanto, las células primarias son necesarias para la experimentación. El desarrollo de un protocolo para el aislamiento y enriquecimiento de las células ganglionares primarias de la retina murina (RGCs) es fundamental para revelar los mecanismos de la salud y la degeneración de RGC in vitro . Esto es especialmente importante para los estudios que buscan generar terapias potenciales para promover la función de RGC y para minimizar su muerte. La degeneración de RGC se asocia con enfermedades degenerativas de la retina, como el glaucoma, la retinopatía diabética y el envejecimiento normal. Aunque los mecanismos celulares específicos subyacentes a la pérdida de RGC no están claros, se han identificado una serie de factores de riesgo. La falta de oxigenación en la cabeza 1 , 2 , 3 del nervio óptico causa la muerte 4 de RGC y actúa como la alteración de la homeostasis entre la activación de la excitación e iNhibitory receptores dentro de RGCs individuales 5 , 6 . Una serie de desafíos impiden el progreso hacia el uso de estas células para estudios en profundidad. En primer lugar, el número de RGC presentes en una retina murina es pequeño. RGCs representan menos del 1% de las células retinianas totales 7 , 8 , 9 . En segundo lugar, la mayoría de los marcadores específicos de RGC son proteínas intracelulares 10 , 11 , 12 . La selección basada en estos marcadores deja las células no viables, lo que impide el análisis funcional posterior. Finalmente, los protocolos actualmente disponibles son largos y carecen de estandarización 13 , 14 . Los primeros protocolos de aislamiento de RGC se basaron en métodos de inmunopanning. Barres et al. 15 Adaptado el clásico immunopY añadió un segundo paso, que excluyó monocitos y células endoteliales de la mayor parte de las células de la retina antes de la selección positiva basada en la inmunopositividad al antígeno anti-timocito (aka Thy1), un marcador de la superficie celular. Años después, Hong et al. Combinado técnicas de aislamiento magnético de grano con estrategias de clasificación celular para aislar RGCs con mayor pureza [ 16] . El uso de cuentas magnéticas todavía se utiliza en muchas aplicaciones científicas. Juntos, las perlas magnéticas y los protocolos de citometría de flujo mejoraron la pureza de las células aisladas. Sin embargo, estos sistemas de purificación aún no han sido estandarizados para el aislamiento de RGC murinos a partir de retina disociada.
La citometría de flujo es un poderoso método analítico que mide las características ópticas y de fluorescencia de las suspensiones celulares. Las células son analizadas tanto cuantitativa como cualitativamente con un alto nivel de sensibilidad, proporcionando un análisis multidimensional de la población celularCión. La discriminación celular se basa en dos propiedades físicas principales: tamaño o superficie de las células y granularidad o complejidad interna 17 . Se puede realizar un análisis multidimensional combinando anticuerpos marcados con fluorocromos que tienen longitudes de onda de excitación similares y diferentes emisiones. La citometría de flujo es rápida, reproducible y sensible. Los láseres multipunto permiten un análisis multidimensional aún mayor de células individuales mediante citometría de flujo. Por lo tanto, es una metodología atractiva para el estudio de especímenes citológicos. Selección de células activadas por fluorescencia (FACS) utiliza las diferencias fenotípicas multidimensionales identificadas por citometría de flujo para clasificar las células individuales en distintas subpoblaciones.
En la última década, se han identificado múltiples proteínas superficiales e intracelulares como biomarcadores potenciales para la selección de células, incluidas las neuronas. Los estudios iniciales que buscaban aislar RGC de ratas utilizaron Thy1 como un ganglio celL marcador. Desafortunadamente, Thy1, también conocido como CD90, tiene múltiples isoformas en otras especies de roedores 18 , 19 , 20 y se expresa por múltiples tipos de células de retina 19 , 20 , lo que lo convierte en un marcador no específico para RGCs. Otro marcador de superficie, CD48, se encuentra en poblaciones monocíticas en la retina, incluyendo macrófagos y microglia. Usando estos dos marcadores de superficie, se desarrolló una firma RGC modificada-Thy1 + y células CD48 neg – 15 , 16 , 21 , 22 . Lamentablemente, estos dos criterios de selección no son suficientes para seleccionar una población RGC altamente enriquecida. Para abordar esta necesidad insatisfecha, se desarrolló un protocolo de citometría de flujo 23 basado en criterios de selección positiva y negativa multicapa usiNg marcadores de superficie celular conocidos para enriquecer y purificar RGCs murinos primarios.
Protocol
Representative Results
Discussion
FACS es la técnica de elección para purificar poblaciones celulares. Otros métodos de aislamiento incluyen el inmunopanning, las perlas magnéticas y el agotamiento de la fijación del complemento. La ventaja de FACS sobre estas otras metodologías se basa en la identificación simultánea de marcadores de superficie celular con diferentes grados de intensidad. La intensidad fluorescente de la molécula es proporcional a la cantidad de expresión de la proteína. Hasta ahora, el aislamiento de RGCs se basó únicamen…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer al Sr. Tim Higgins, Illustrator Senior del Departamento de Microbiología, Inmunología y Bioquímica, por la asistencia técnica de video; Dr. Matthew W. Wilson para las discusiones y los miembros de los laboratorios Jablonski y Morales-Tirado por sus útiles comentarios. Este trabajo fue apoyado por el Premio al Investigador Joven del Instituto de Investigación Alcon (VMM-T), la Fundación de Investigación de la Universidad de Tennessee (VMM-T), el Instituto Nacional del Ojo EY021200 (MMJ), el Gerwin Fellowship (VMM-T); La Beca de Pre-doctorado Gerwin (ZKG), el Departamento de Defensa del Ejército de Investigación Médica y el Comando de Materiales (VMM-T), y la subvención no restringida de la investigación para prevenir la ceguera.
Materials
| Anti-mouse CD15 PE | BioLegend | 125606 | Clone MC-480 |
| Anti-mouse CD48 PE-Cy7 | BioLegend | 103424 | Clone HM48-1 |
| Anti-mouse CD57 | Sigma Aldrich | C6680-100TST | Clone VC1.1 |
| Anti-mouse CD90.2 AF700 | BioLegend | 105320 | Clone 30-H12 |
| Brilliant Violet 421 Goat Anti-mouse IgG | BioLegend | 405317 | Clone Poly4053 |
| Purified Anti-mouse CD16/32 | BioLegend | 101302 | FcgRII/III block, Clone 93 |
| Zombie Aqua | BioLegend | 423102 | Live cell/ Dead cell discrimination |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30071.03 | U.S. origin |
| AbC Total Antibody Compensation Bead Kit | Thermo Fisher Scientific | A10497 | Multi-species Ig |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | Add serum to media prior to culture. |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | Saline solution |
| Dissection Microscope | Olympus | SZ-PT Model | Stereo Microscope |
| Sorvall Centrifuge | Thermo Scientific | ST 16R | All centrifugation performed at RT |
| Base Plate – Dissection Pan | Fisher Scientific | SB15233FIM | A wax plate can also be used |
| Forceps | Aesculap | 5002-7 | 4 ½ inches |
| Iris Scissors, Straight | Aesculap | 1360 | 5 ½ inches |
| Falcon 15 mL conical tubes | Fisher Scientific | 352097 | Polypropylene tubes |
| Falcon 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 352098 | Polypropylene tubes |
| BD FACS Tubes | Fisher Scientific | 352003 | Polypropylene tubes |
| 40 mm dishes | MidSci | TP93040 | Tissue culture treated |
| 70 μm nylon strainer | MidSci | 70ICS | sterile |
| 40 μm nylon strainer | MidSci | 40ICS | sterile |
| BD 10 mL syringe | Fisher Scientific | 301604 | Disposable Syringe without needle |
| Pestles | MidSci | PEST | sterile |
| Wheaton Vials | Fisher Scientific | 986734 | No Liner |
| BD 30 G needle | Fisher Scientific | 305128 | 1 inch |
| Hausser Scientific Bright-Line Glass Counting Chamber | Fisher Scientific | 0267151B | Hemocytometer |
| Gibco Trypan blue 0.4% Solution | Fisher Scientific | 15250061 | Viability Dye |
| Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 05-402-25 | 1.5mL |
| EVOS Floid Cell Imaging | Thermo Fisher Scientific | 447113 | Fluorescence Imaging with a 20x objective |
| 100% Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-452 | Used to make 70% Ethanol |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ | Rainin | 17014282 | LTS Pipette |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+ | Rainin | 17014391 | LTS Pipette |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+ | Rainin | 17014392 | LTS Pipette |
| Rack LTS 1000 mL – GPS-L1000S | Rainin | 17005088 | Blue Rack Sterile Tips |
| Rack LTS 250 mL – GPS-L250S | Rainin | 17005092 | Green Rack Sterile Tips |
| Rack LTS 20 mL – GPS-L10S | Rainin | 17005090 | Red Rack Sterile Tips |
| FACSAria II Cell Sorter | BD Biosciences | N/A | Custom order |
| LSR II Cytometer | BD Biosciences | N/A | Custom order |
| Abca8a | Thermo Fisher Scientific | Mm00462440_m1 | Müller cells |
| Aldh1al | Thermo Fisher Scientific | Mm00657317_m1 | Müller cells |
| Aqp4 | Thermo Fisher Scientific | Mm00802131_m1 | Astrocytes |
| Calb2 | Thermo Fisher Scientific | Mm00801461_m1 | Amacrine, Horizontal |
| Cd68 | Thermo Fisher Scientific | Mm03047340_m1 | Retinal Pigment Epithelial Cells |
| Gad2 | Thermo Fisher Scientific | Mm00484623_m1 | Amacrine |
| Hprt | Thermo Fisher Scientific | Mm01545399_m1 | House keeping gene |
| Lhx1 | Thermo Fisher Scientific | Mm01297482_m1 | Horizontal |
| Lim2 | Thermo Fisher Scientific | Mm00624623_m1 | Horizontal |
| Nrl | Thermo Fisher Scientific | Mm00476550_m1 | Photoreceptors |
| Ntrk1 | Thermo Fisher Scientific | Mm01219406_m1 | Horizontal |
| Pcp4 | Thermo Fisher Scientific | Mm00500973_m1 | Bipolar, Amacrine |
| Pou4f1 | Thermo Fisher Scientific | Mm02343791_m1 | Retinal Ganglion Cells |
| Prdx6 | Thermo Fisher Scientific | Mm00725435_s1 | Astrocytes |
| Prkca | Thermo Fisher Scientific | Mm00440858_m1 | Bipolar |
| Prox1 | Thermo Fisher Scientific | Mm00435969_m1 | Horizontal |
| Pvalb | Thermo Fisher Scientific | Mm00443100_m1 | Amacrine |
| Rbpms | Thermo Fisher Scientific | Mm02343791_m1 | Retinal Ganglion Cells |
| Rom1 | Thermo Fisher Scientific | Mm00436364_g1 | Photoreceptors |
| Rpe65 | Thermo Fisher Scientific | Mm00504133_m1 | Retinal Pigment Epithelial cells |
| Slc1a3 | Thermo Fisher Scientific | Mm00600697_m1 | Astrocytes |
| Slc6a9 | Thermo Fisher Scientific | Mm00433662_m1 | Amacrine |
| Sncg | Thermo Fisher Scientific | Mm00488345_m1 | Retinal Ganglion Cells |
| Tubb3 | Thermo Fisher Scientific | Mm00727586_s1 | Retinal Ganglion Cells |
| Vim | Thermo Fisher Scientific | Mm01333430_m1 | Müller cells |
| Taqman Universal Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4440047 | qPCR Reagent |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | RNA Isolation |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | 11754250 | cDNA synthesis |
| Taqman PreAmp Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4391128 | Pre-Amplification step |
| BD Cytofix/ Cytoperm | BD Biosciences | 554714 | Fixation/ Permeabilization Buffer |
| BD Perm/ Wash | BD Biosciences | 554723 | Permeabilization Solution |
| RBPMS | Santa Cruz Biotechnology | sc-86815 | intracellular antibody |
| SNCG | Gene Tex | GTX110483 | intracellular antibody |
| BRN3A | Santa Cruz Biotechnology | sc-8429 | intracellular antibody |
| TUJ1 | BioLegend | 801202 | intracellular antibody |
Referências
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