Seção de mamíferos mamários completos para identificação de lesões
Summary
Desenvolvemos um método para remover, processar, cortar e manchar com sucesso, para avaliação histopatológica, tecido mamário que inicialmente havia sido fixado em slides como montagens inteiras. Este método pode promover a coleta e avaliação de montantes inteiros de glândula mamária em estudos de diretrizes de testes reprodutivos e de desenvolvimento.
Abstract
O desenvolvimento normal da glândula mamária pode ser alterado pela exposição a substâncias tóxicas ambientais e produtos farmacêuticos, exposição excessiva a hormonas e alterações genéticas. As montagens inteiras da glândula mamária são um método barato para capturar a progressão das alterações morfológicas que podem surgir após a exposição. No entanto, na vida posterior, quando as anormalidades são mais propensas a desenvolver, a única dependência deste método pode nem sempre fornecer informações suficientes para fazer um diagnóstico adequado da anormalidade. Historicamente, em estudos de diretrizes de teste químico, uma única glândula mamária é removida na necropsia e preparada como uma seção mantida com hematoxilina e eosina (H & E). A incorporação de coleta e análise de mamíferos contralaterais inteiros diminui a probabilidade de uma avaliação falso-negativa. A avaliação de todo o suporte é limitada pela presença de uma ou duas glândulas mamárias inteiras em um slide e, em alguns casos, as anormalidades observadas em todo o suporte não sãoT uniformemente representado na seção H & E. O objetivo deste estudo foi desenvolver um protocolo para a conversão de montagens completas mamárias revestidas em seções manchadas de H & E para que as lesões que de outra forma tenham sido perdidas ou que sejam difíceis de diagnosticar possam ser identificadas. Aqui, detalhamos um método para produzir uma seção de H & E integrada em parafina de alta qualidade de uma glândula mamária que inicialmente foi preparada como uma montagem total. Em comparação com um tecido que foi intencionalmente preparado para seção de H & E, todo o suporte requer preparação adicional para remoção e processamento de tecido. No entanto, este método é considerado barato, uma vez que requer reagentes de laboratório comuns e pouco tempo adicional. Como resultado, este método pode fornecer informações inestimáveis sobre como as exposições químicas e ambientais alteram o desenvolvimento mamário normal, bem como exibir mudanças que ocorrem devido a modificações genéticas.
Introduction
O mountis completo mamário é um método útil e barato implementado em muitos estudos de ratos e ratos para entender o desenvolvimento anormal e induzido quimicamente. Em geral, uma glândula mamária coletada em vários estágios durante o desenvolvimento de roedores ( ou seja, adolescência, puberdade, gestação média e tardia e fase de involução) mostrará mudanças morfológicas na arquitetura celular e celular influenciada por fatores paracrinos, endócrinos e autocrinos 1 . No rato envelhecido, as porções epiteliais e estromadas da glândula tornam-se cada vez mais densas, o que dificulta a medição de parâmetros morfológicos em um monte inteiro. Assim, é prática comum coletar uma glândula para avaliação histológica para identificar mudanças em um nível microscópico. Ambos os processos são especialmente úteis em estudos envolvendo exposição química ( ou seja, ambiental ou farmacêutico) ou para examinar as alterações morfológicas acompanhadas de alterações genéticasAções.
Técnicas e capacidades para usar a glândula mamária na avaliação de risco continuam a evoluir. Embora a preparação de montagem total seja rotineira e padronizada, as modificações na seção continuam 2 , 3 . Muitos grupos de pesquisa de diferentes origens ( ie, academia, governo e indústria) adaptaram as seções coronal / longitudinal do tecido mamário como um método preferido, enquanto alguns laboratórios ainda usam cortes transversais através da pele 4 . O último método resulta em uma representação desordenada da epiderme (pele), em vez do tecido de interesse: o epitélio da glândula mamária 2 . As seções coronais ou longitudinais são mais úteis para caracterizar o tecido normal 5 e melhoram muito a detecção de anormalidades e lesões devido ao aumento da área de superfície e ao número de estruturas presentes. No geral, isso faz com que todo o mundoNão é um método adequado para a avaliação histopatológica comparativa da glândula mamária 1 , 2 . Quer usando um ratinho ou um rato, a recuperação e a conservação do 4 e 5 de gânglios inguinais é altamente recomendada para a comparação do conjunto de montagem para uma secção contralateral H & E.
Quando usado em combinação, a seção H & E e a montagem total fornecem uma conta precisa das mudanças celulares e morfológicas induzidas pela exposição ambiental. Isto é especialmente verdadeiro em certas cepas de roedores nas quais o modelo possui uma baixa susceptibilidade à formação de tumor ou um tumor não é visivelmente visível. Em algumas circunstâncias, a obtenção do tecido necessário nem sempre é possível usando ambas as técnicas ( ou seja, quantidade de tecido insuficiente, recursos ou resultados experimentais inesperados). No nosso caso, observaram-se anormalidades no conjunto total mamário, enquanto o histopathoOs achados lógicos na glândula contrárea H & E foram na sua maioria normais. A discrepância esmagadora entre as glândulas contralaterais nos levou a desenvolver um procedimento econômico e eficiente para identificar as anormalidades em toda a montagem. Utilizando um procedimento de processamento e incorporação modificado, foram preparadas secções coloridas com H & E de alta qualidade a partir de montagens inteiras integradas em parafina. Imaginamos que este protocolo se torne uma poderosa ferramenta de detecção para efeitos de exposição química, aumentando as comparações entre laboratórios.
Protocol
Representative Results
Discussion
A montagem completa da glândula mamária é uma ferramenta poderosa que pode ser usada para ilustrar o desenvolvimento mamário normal e as alterações morfológicas que podem surgir e persistir após a exposição a produtos químicos, incluindo os disruptores endócrinos. Quando uma montagem completa e a seção H & E do mesmo animal são avaliadas em conjunto, elas podem fornecer uma imagem instantânea precisa de alterações precoces, que podem avançar para um estado mais doente.
…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de reconhecer Pam Ovwigho, Tenette Jones e Natasha Clayton, NIEHS, por sua experiência técnica e suporte com este projeto.
Materials
| Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| Permount | Thermo Fisher Scientific | SP15-100 | mounting media for coverslipping whole mounts and H&E sections |
| Leica automated processor | Leica Biosystems | Model # ST5020 | |
| HM 355S Automatic Microtome | Thermo Fisher Scientific | 905200 | |
| Paraffin | Leica Biosystems | EM-400 | |
| Superfrost plus microscope slides | Thermo Fisher Scientific | 4951PLUS-001 | electrostatically charged |
| Fisher Finest 24x60x1 | Thermo Fisher Scientific | 12-548-5P | coverslips |
| Varistain Gemini ES Automatic slide stainer | Thermo Fisher Scientific | A78000014 | |
| Sta-On | Leica Biosystems | 3803107 | liquid adhesive; used in water bath at sectioning |
| Modified Harris Hematoxylin 72711 | Richard-Allan Scientific (Part of Thermo Scientific) | 72711 | |
| Eosin | Leica Biosystems | 3801600 | |
| Lithium Carbonate | SkyTech Laboratories | LCQ500 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo Fisher Scientific | A38-500 | needed in Carnoy's fixative |
| Chloroform | Macron Fine Chemicals | 4440-04 | needed in Carnoy's fixative |
| 100% Ethanol | The Warner Graham Company | 6505001050000 | needed in Carnoy's fixative and washing slides |
| 95% Ethanol | The Warner Graham Company | 6505011137320190 | |
| Carmine Alum | Sigma-Aldrich | C1022-25G | |
| Aluminum potassium sulfate dodecahydrate, Sigma Ultra | Sigma-Aldrich | A7210-500G | |
| Automation wash buffer, 20X | Biocare Medical | TWB945 |
Referências
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