הערכה של רשת Sarcoplasmic סידן סידן הדיאסטולי שימור, תאיים הסרת Cardiomyocytes חדרית מבודד

Summary

סידן תאיים מיחזור שמשחק תפקיד בוויסות של תפקוד סיסטולי, דיאסטולי אצל cardiomyocytes. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול כדי להעריך sarcoplasmic רשת Ca^{2 +} שמורת ובפונקציה הסרת סידן הדיאסטולי ב cardiomyocytes מאת סידן מערכת הדמיה.

Abstract

סידן תאיים מיחזור שמשחק תפקיד בוויסות של תפקוד סיסטולי, דיאסטולי אצל cardiomyocytes. Sarcoplasmic הלב רשת (SR) משמש Ca^{2 +} מאגר של התכווצות, אילו reuptakes תאיים Ca^{2 +} במהלך הרפיה. SR Ca^{2 +} השמורה זמין עבור פעימות קבוע עבור contractibility לב, הסרת Ca תאיים^{2 +} היא קריטית לתפקוד לב diastolic. בתנאים מסוימים הקשורים pathophysiological, כגון סוכרת, אי ספיקת לב, סיווג לקוי סידן ו- SR Ca^{2 +} בחנות cardiomyocytes עשויים להיות מעורבים ההתקדמות בתפקוד הלב. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול להעריך SRCa^{2 +} מילואים והסרה הדיאסטולי Ca^{2 +} . בקצרה, cardiomyocyte יחיד הופרדה enzymatically, Ca^{2 +} זריחה תאיים שמציין Fura-2 הוקלט על-ידי מערכת הדמיה סידן. להעסיק קפאין להשראת SR Ca^{2 +} משחרר לגמרי, אנחנו מראש תוכנית מתג זלוף אוטומטית על-ידי interlinking מערכת גירוי ומערכת זלוף. לאחר מכן, ההתאמה עקומה מעריכית-מונו שימש לניתוח קבועי זמן דעיכה של סידן שנחשולי וקטניות קפאין-induced סידן. בהתאם לכך, את התרומה של SR Ca^{2 +}-ATPase (SERCA) ו- Na⁺-Ca^{2 +} מחליף (NCX) להסרת סידן הדיאסטולי הוערך.

Introduction

סידן תאיים ([Ca^{2 +}]_אני) מיחזור ממלאת תפקיד קריטי בתקנה של תפקוד סיסטולי, דיאסטולי cardiomyocytes¹. כפי שאנו יודעים, הנוצרות על-ידי סידן Ca^{2 +} השחרור יוזם עירור-התכווצות מצמד, אשר תרגם את האות החשמלי התכווצות. ממברנה דפולריזציה הפעלת ה-Ca L-סוג sarcolemmal^{2 +} ערוצי, אשר זירוז Ca^{2 +} לשחרר from SR לתוך הציטופלסמה באמצעות קולטנים ryanodine 2 (RyR2). ארעי מוגברות cytoplasmic Ca^{2 +} יוזם התכווצות של myofibrils. במהלך diastole, cytoplasmic Ca^{2 +} היא reuptaken לתוך SR באמצעות SR Ca^{2 +}-ATPase 2 (SERCA2) לפחות לא יצא cardiomyocyte דרך Na⁺-Ca^{2 +} מחליף (NCX)². תהליך זה מוביל להתכווצות-הרפיה מיחזור ב cardiomyocyte.

SR הלב היא רשת תאיים קרום העוטף את מכונות כויץ. היא משמשת מאגר^{2 +} Ca עבור התכווצות, זה reabsorbs Ca תאיים^{2 +} במהלך הרפיה. SR Ca^{2 +} השמורה זמין עבור פעימות הוא קבוע עבור contractility לב. בינתיים, הסרת Ca תאיים^{2 +} הוא קריטי עבור diastole הלב. בתנאים מסוימים הקשורים pathophysiological, כגון סוכרת, אי ספיקת לב, Ca^{2 +} סיווג לקוי ו- SR Ca מדוכא^{2 +} חנות cardiomyocytes עשויים להיות מעורבים בתהליך בתפקוד הלב^{2,3 ,4}.

למדידת SR Ca^{2 +} שחרור, Ca דיאסטולי^{2 +} הסרת cardiomyocytes, ישנן שתי גישות בשימוש נרחב: השלמות של הזרם NCX המבוסס על תיקון-קלאמפ^5,6ו- Ca קפאין-induced ^{2 +} דופק בהתבסס על האישורים^{2 +} זריחה הדמיה^7,8,9. הגישה תלויה העובדה כי Ca^{2 +} שוחררה מבית SR במידה רבה נשאבים מחוץ לתאים על-ידי NCX. עם זאת, גישה זו הוא מוגבל על ידי שלה הדרישה של המבצע מיומן וציוד מתקדם. במחקר הנוכחי, אנו מתארים גישה נוחה כדי להעריך SR Ca^{2 +} שמורת Ca^{2 +} הסרת השריר על ידי מדידת קפאין-induced Ca^{2 +} דופק המבוסס על Ca^{2 +} זריחה הדמיה מערכת. בקצרה, Ca תאיים^{2 +} זריחה שציין Fura-2. על ידי interlinking על גירוי מערכת ומערכת זלוף, אנו מציגים תוכנית עבור החלפת את זלוף, צועד המערכת באופן אוטומטי. 10 מ מ קפאין הועסק לזירוז במהירות Ca^{2 +} שחרור מוחלט האב קבועי זמן דעיכה מעריכית (טאו) של סידן שנחשולי וקטניות קפאין-induced סידן, התקבלו עקומה מעריכית-מונו מתאים, אשר משקפים את התרומה של SERCA ו- NCX הדיאסטולי Ca^{2 +} להסרת בהתאם.

Protocol

כל הניסויים בוצעו על פי פרוטוקולים אושרה על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועד שימוש מרכז מחקר ניסיוני, סין האקדמיה הסינית למדעי הרפואה, אונ’ ג’יאנג. 1-פתרון הכנה להכין את כל הפתרונות כפי שמתואר בטבלה 1. 2. בידוד של שמאל חדרית (LV) Cardiomyocytes <p class="jove_…

Representative Results

כאן, אנחנו להמחיש streptozotocin (STZ) – induced חולדות סוכרתית (DM) ותואמים גיל-ספראג – Dawley (SD) חולדות לדוגמה. חולדות SD זכר בן שבוע 8 (± 200 20 גרם) קיבל זריקה אחת בקרום הבטן של STZ (70 מ”ג/ק”ג, ip) עבור מיט קבוצה או ציטראט המאגר עבור קבוצת הביקורת. שבוע אחרי STZ מינהל, חולדות עם הסוכר > 16.7 mmol/L נחשבו סו…

Discussion

סידן פלאקס שוחררו את SR היא Ca^{2 +} המקור העיקרי עבור סיסטולה בלב. במידה מסוימת, את משרעת של SR Ca^{2 +} תוכן של ה-Ca החלקי^{2 +} שוחרר את SR משקפים את SR Ca^{2 +} שמורת זמין עבור התכווצות הלב. מצד שני, השמורה^{2 +} Ca של SR תלויה ביכולת של SR Ca^{2 +} ספיגה חוזרת, Ca^{2 +} דליפה של SR ואיזון שלהם …

Materials

NaCl	Alfa Aesar	E31K43
MgCl2	Alfa Aesar	I02T070
KCl	Alfa Aesar	G22u018
HEPEs	Sigma	SLBM 7880V
D-Glucose	Alfa Aesar	10189341
NaOH	Alfa Aesar	10154048
KOH	Alfa Aesar	10144B17
KH2PO4	Alfa Aesar	F21S033
MgSO4	Alfa Aesar	C31U038
L-Glutamic	Alfa Aesar	10149849
Taurine	Alfa Aesar	J5407a
EGTA	Sigma	SLBM6826V
Collagenase A	Roche	10103586001
Collagenase Type II	Worthington	45k16005
BSA	Roche	735094
caffeine	Sigma	C0750
Fura-2 AM	Invitrogen	F1201
Microscope	Olympus	Olympus IX 71
Langendorff system	Beijing Syutime Technology Co	PlexiThermo-S-LANGC
Micromanipulator	Marchauser	MM33 links
Perfusion chamber	IonOptix	FHD
Valve Controlled Gravity Perfusion System	ALA	VC 3-8
valve commander software	ALA	VC 3 1.0.1.2
Precision flow regulator	Delta Med	3204315
Multi-Barrel Manifold Perfusion Pencil	AutoMate Scientific	04-08-[360]
Micron Removable Tip	AutoMate Scientific	360um i.d.
Fluorescence Measurement and Cell Dimensioning Systems	IonOptix	Hyperswitch
Recording software	IonOptix	IonWizard 6.2.59
Stimulator	IonOptix	MyoPacer EP
Sprague-dawley rats	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co.	SCXK 2016-01-007436