肌网钙储备与细胞内舒张钙在心室肌细胞中的分离评价

Summary

细胞内钙循环对心肌细胞收缩和舒张功能的调节起着至关重要的作用。在这里, 我们描述了一个协议, 以评估肌网钙^{2 +}储备和舒张钙功能的心肌细胞钙显像系统。

Abstract

细胞内钙循环对心肌细胞收缩和舒张功能的调节起着至关重要的作用。心脏肌网 (SR) 担当一个 Ca^{2 +}水库为收缩, reuptakes 细胞内 Ca^{2 +}在放松期间。用于心跳收缩的 SR Ca^{2 +}准备金是确定的, 而移除胞内 Ca^{2 +}对心脏舒张功能至关重要。在一些病理生理学条件下, 如糖尿病和心力衰竭, 受损的钙清除和 SR 钙^{2 +}存储在心肌细胞可能涉及心脏功能障碍的进展。在这里, 我们描述一个协议来评估 SRCa^{2 +}保留和舒张期 Ca^{2 +}删除。简单地说, 一个单一的心肌细胞被酶分离, 并通过钙显像系统记录 Fura-2 所示的胞内钙^{2 +}荧光。为了使用咖啡因诱导总 SR Ca^{2 +}释放, 我们预设了一个自动灌注开关程序通过相互关联的刺激系统和灌注系统。然后用单指数曲线拟合法分析钙瞬变和咖啡因诱导的钙离子脉冲的衰变时间常数。因此, 评价了 SR ca^{2 +}atp 酶 (SERCA) 和 Na⁺-ca^{2 +}交换器 (NCX) 对舒张钙的贡献。

Introduction

细胞内钙 ([Ca^{2 +}]_i) 回收在心肌细胞收缩和舒张功能调节中起着关键作用¹。正如我们所知道的, 钙诱导 Ca^{2 +}释放启动的励磁收缩耦合, 这将电信号转换为收缩。膜去极化激活心肌 L 型 ca^{2 +}通道, 通过兰尼受体 2 (RyR2) 诱导从 SR 到细胞质的 ca^{2 +}释放。瞬时升高的细胞质 Ca^{2 +}启动收缩的纤维。在舒张期间, 细胞质钙^{2 +}通过 sr Ca^{2 +}atp 酶 2 (SERCA2) reuptaken 进入 sr, 并通过 Na⁺-Ca^{2 +}交换器 (NCX)²从心肌细胞中抽出。这个过程导致收缩-松弛循环在心肌细胞。

心脏 SR 是一个细胞内膜网络周围的收缩机械。它作为一个 ca^{2 +}的收缩库, 它吸收细胞内 ca^{2 +}在放松。可用于节拍的 SR Ca^{2 +}准备金是确定心脏收缩力的方法。同时, 移除细胞内钙^{2 +}对于心脏舒张是至关重要的。在一些病理生理学条件下, 如糖尿病和心力衰竭, 受损的 ca^{2 +}清除和抑郁症的 SR ca^{2 +}存储在心肌细胞可能涉及心脏功能障碍的过程^{2,3 ,4}。

对于在心肌细胞中测量 SR ca^{2 +}释放和舒张期 ca^{2 +} , 有两种广泛使用的方法: 基于膜片钳^5、6和咖啡因诱导的 ca 的 NCX 电流的完整性^{2 +}脉冲基于 Ca^{2 +}荧光成像^7,8,9。前者的方法取决于这样一个事实: 从 SR 中释放的 Ca^{2 +}主要是通过 NCX 从单元格中抽取出来的。然而, 这种方法是有限的, 其要求先进的设备和熟练的操作。在本研究中, 我们描述了一种简便的方法来评估 SR ca^{2 +}储备和 ca^{2 +}去除在心肌细胞通过测量咖啡因诱导的 ca^{2 +}脉冲的基础上的 ca^{2 +}荧光成像系统。简单地说, 胞内 Ca^{2 +}荧光由 Fura-2 表示。通过对刺激系统和灌注系统的相互关联, 提出了一种自动切换灌注和起搏系统的方案。10毫米咖啡因被用来迅速诱导总 Ca^{2 +}释放在 SR。从单指数曲线拟合得到了钙瞬变和咖啡因诱导的钙离子脉冲的指数衰减时间常数 (Tau), 反映了 SERCA 和 NCX 对舒张 Ca 的贡献^{2 +} 。

Protocol

所有动物实验都是按照中国医学科学院和浙江大学实验研究中心机构动物保育与使用委员会批准的协议进行的. 1. 解决方案准备 准备 表 1 . 中所述的所有解决方案 2. 分离左心室 (lv) 心肌细胞 注意: LV 心肌细胞被隔离酶使用 Langendroff 灌注系统, 如前所述 7 , 8 <sup…

Representative Results

在这里, 我们举例说明链脲佐菌素 (DM) 和年龄匹配的大 (SD) 大鼠的糖尿病大鼠。8周大的雄性 SD 大鼠 (200 ±20克) 接受了单腹腔注射脲佐菌素 (70 毫克/千克, ip) 为 DM 组或枸橼酸的控制组的缓冲。一周后, 有血糖和 #62 的老鼠, 16.7 摩尔/L 被认为是糖尿病。8周后, 左心室肌细胞酶分离。在钙重新引入后, 大约有 70-80% 的心肌细胞存活在生存状态。只有杆状细胞, 清晰的条纹, 和稳定?…

Discussion

从 SR 释放的钙通量是心脏收缩的主要的 Ca^{2 +}来源。在某种程度上, sr ca^{2 +}内容的振幅和从锶中释放出来的分数 ca^{2 +}反映了 sr ca^{2 +}保留可用于心脏收缩。另一方面, ca^{2 +}保留的 sr 依赖于 sr ca^{2 +}再的能力、ca^{2 +}泄漏的 sr, 以及它们在舒张期间的 sr、^12、13、14之间的平衡。在我?…

Materials

NaCl	Alfa Aesar	E31K43
MgCl2	Alfa Aesar	I02T070
KCl	Alfa Aesar	G22u018
HEPEs	Sigma	SLBM 7880V
D-Glucose	Alfa Aesar	10189341
NaOH	Alfa Aesar	10154048
KOH	Alfa Aesar	10144B17
KH2PO4	Alfa Aesar	F21S033
MgSO4	Alfa Aesar	C31U038
L-Glutamic	Alfa Aesar	10149849
Taurine	Alfa Aesar	J5407a
EGTA	Sigma	SLBM6826V
Collagenase A	Roche	10103586001
Collagenase Type II	Worthington	45k16005
BSA	Roche	735094
caffeine	Sigma	C0750
Fura-2 AM	Invitrogen	F1201
Microscope	Olympus	Olympus IX 71
Langendorff system	Beijing Syutime Technology Co	PlexiThermo-S-LANGC
Micromanipulator	Marchauser	MM33 links
Perfusion chamber	IonOptix	FHD
Valve Controlled Gravity Perfusion System	ALA	VC 3-8
valve commander software	ALA	VC 3 1.0.1.2
Precision flow regulator	Delta Med	3204315
Multi-Barrel Manifold Perfusion Pencil	AutoMate Scientific	04-08-[360]
Micron Removable Tip	AutoMate Scientific	360um i.d.
Fluorescence Measurement and Cell Dimensioning Systems	IonOptix	Hyperswitch
Recording software	IonOptix	IonWizard 6.2.59
Stimulator	IonOptix	MyoPacer EP
Sprague-dawley rats	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co.	SCXK 2016-01-007436