격리 된 심 실 Cardiomyocytes에 Sarcoplasmic 그물 칼슘 예비 및 세포내 확장기 칼슘 제거의 평가

Summary

세포내 칼슘 재활용 cardiomyocytes에 수축 기 및 diastolic 기능의 규칙에 있는 중요 한 역할을 하고있다. 여기, 우리가 칼슘 이미징 시스템에 의해 sarcoplasmic 그물 캘리포니아^{2 +} 예약 및 cardiomyocytes에 확장기 칼슘 제거 기능을 평가 하는 프로토콜을 설명 합니다.

Abstract

세포내 칼슘 재활용 cardiomyocytes에 수축 기 및 diastolic 기능의 규칙에 있는 중요 한 역할을 하고있다. 심장 sarcoplasmic 그물 (SR) Ca^{2 +} 수축, 어떤 reuptakes 세포내 캘리포니아^{2 +} 휴식 동안에 대 한 저수지 역할을 합니다. SR Ca^{2 +} 예약 비트 사용할 수 심장 contractibility에 대 한 결정 이며, 세포내 캘리포니아^{2 +} 의 제거는 심장 심장 확장 기능에 대 한 중요 한. 당뇨병과 심장 마비 같은 병 태 생리 조건에서 장애인된 칼슘 클리어런스 및 SR Ca^{2 +} 저장소 cardiomyocytes에 심장 부전의 진행에 관련 수 있습니다. 여기, 우리는 미술관^{2 +} 예약 및 확장기 Ca^{2 +} 제거 프로토콜을 설명 합니다. 간단히, 단일 cardiomyocyte 효소 고립 되었고 세포내 캘리포니아^{2 +} 형광 Fura-2에 표시 된 칼슘 이미징 시스템에 의해 기록 되었다. 총 SR 캘리포니아^{2 +} 릴리스 유도 대 한 카페인을 고용, 우리 interlinking 자극 시스템 및 관류 시스템에 의해 자동 관류 스위치 프로그램을 미리. 다음, 모노 지 수 곡선 피팅 칼슘 과도 및 카페인을 이용한 칼슘 펄스의 붕괴 시간 상수를 분석 하는 데 사용 되었다. 따라, 기여의 SR 캘리포니아^{2 +}-ATPase (SERCA) 및 Na⁺-캘리포니아^{2 +} 교환기 (NCX) 확장기 칼슘 제거를 평가 했다.

Introduction

세포내 칼슘 ([캘리포니아^{2 +}]_나) 재활용 cardiomyocytes¹에서 수축 기 및 확장기 함수 규칙에 있는 중요 한 역할을 하고있다. 우리가 알고 있듯이, 칼슘 유도 Ca^{2 +} 릴리스는 수축 하는 전기 신호를 변환 시킵니다 흥분 수축 연결, 시작 합니다. 막 도발은 유도 캘리포니아^{2 + 2 +} 채널, SR에서 ryanodine 수용 체 2 (RyR2)를 통해 세포질으로 출시 sarcolemmal L 형 Ca를 활성화 합니다. 과도 높은 세포질 캘리포니아^{2 +} myofibrils의 수축을 시작합니다. SR 캘리포니아^{2 +}를 사용 하 여 SR에 reuptaken는 심장, 동안 세포질 캘리포니아^{2 +} -ATPase 2 (SERCA2)와 나⁺-캘리포니아^{2 +} 교환기 (NCX)²를 통해 cardiomyocyte 밖으로 펌핑. 이 프로세스는 cardiomyocyte 재활용 수축-이완 이끌어 낸다.

심장 SR은 세포내 막 네트워크 주변 수축 성 기계입니다. 그것은 캘리포니아^{2 +} , 수축에 대 한 저수지 역할을 하 고 reabsorbs 세포내 캘리포니아^{2 +} 휴식 중. SR 캘리포니아^{2 +} 예약 비트 사용할 수 심장 수축에 대 한 결정 이다. 한편, 세포내 캘리포니아^{2 +} 의 제거가 심장 심장에 대 한 중요 합니다. 일부 병 태 생리 조건 등 당뇨병과 심장 마비, 장애인된 캘리포니아^{2 +} 클리어런스 우울 SR 캘리포니아^{2 +} cardiomyocytes에 저장소 관련 되어있을 수 있습니다 심장 부전^{2,3 과정 ,4}.

SR 캘리포니아^{2 +} 릴리스 및 cardiomyocytes에 확장기 Ca^{2 +} 제거 측정, 널리 사용 되는 방법은 두 가지: 패치 클램프^5,6, 카페인 유발 Ca 기반으로 NCX 전류의 무결성 ^{2 +} 캘리포니아^{2 +} 형광 이미징^7,,89에 따라 펄스. 전 접근 그는 캘리포니아^{2 +} SR에서 발표는 크게 셀에서에 의해 펌핑 NCX 사실에 따라 달라 집니다. 그러나,이 접근의 고급 장비와 숙련 된 작업의 요구에 의해 제한 됩니다. 현재 연구에서 우리가 SR 캘리포니아^{2 +} 예비 그리고 캘리포니아^{2 +} 제거 myocytes에서 카페인 유발 Ca^{2 +} 펄스는 캘리포니아^{2 +} 형광 이미징 시스템에 따라 측정 하 여 평가 하는 편리한 접근 방식을 설명 합니다. 간단히, 세포내 캘리포니아^{2 +} 형광 Fura-2로 표시 됩니다. Interlinking 자극 시스템 및 관류 시스템, 선물이 관류를 전환 하 고 시스템을 자동으로 속도 위한 프로그램. 10mm 카페인 빠르게는 미스터에 총 캘리포니아^{2 +} 출시를 유도 하기 위해 고용 되었다 지 수 감퇴 시간 상수 (타우) 칼슘 과도 및 카페인을 이용한 칼슘 펄스의 확장기 캘리포니아^{2 +} 제거 SERCA NCX의 기여를 적절 하 게 반영 하는 피팅, 모노 지 수 곡선에서 얻은 했다.

Protocol

모든 동물 실험 기관 동물 관리 및 사용 실험 연구 센터, 중국 과학 아카데미의 중국 의료 및 절 강 대학에 위원회에 의해 승인 하는 프로토콜에 따라 수행 되었습니다. 1. 솔루션 준비 표 1에 설명 된 대로 모든 솔루션을 준비. 2. 격리의 왼쪽 심 실 (LV) Cardiomyocytes 참고: LV cardiomyocytes는 효소 Langendroff 관류 시스?…

Representative Results

여기, 우리가 설명 streptozotocin (STZ)-당뇨병 쥐 (DM)를 유도 및 나이 일치 Sprague-Dawley (SD) 쥐 예. 8 주 오래 된 남성 SD 쥐 (200 ± 20g) 컨트롤 그룹에 대 한 DM 그룹 또는 구 연산 염 버퍼 STZ (70 mg/kg, ip)의 단일 복 주사를 받았다. STZ 관리 후 1 주일 혈당과 쥐 > 16.7 mmol/L 당뇨병으로 간주 됐다. 8 주 후, LV myocytes 효소 격리 했다. 칼슘 reintroduction 후 myocytes 생존 상태에 남아 있는의 약 7…

Discussion

SR에서 발표 하는 칼슘 속은 systole에에서 대 한 주요 캘리포니아^{2 +} 소스입니다. 어느 정도, SR 캘리포니아^{2 +} 콘텐츠의 진폭 및 소수 Ca^{2 +} SR에서 발표 반영 SR Ca^{2 +} 예비 심장 수축에 사용할 수 있는. 다른 한편으로, SR의 Ca^{2 +} 예약에 따라 SR 캘리포니아^{2 +} 재흡수, SR의 캘리포니아^{2 +} 누출 그리고 그들의 균형의 능력 SR에 걸쳐 심장^12<…

Materials

NaCl	Alfa Aesar	E31K43
MgCl2	Alfa Aesar	I02T070
KCl	Alfa Aesar	G22u018
HEPEs	Sigma	SLBM 7880V
D-Glucose	Alfa Aesar	10189341
NaOH	Alfa Aesar	10154048
KOH	Alfa Aesar	10144B17
KH2PO4	Alfa Aesar	F21S033
MgSO4	Alfa Aesar	C31U038
L-Glutamic	Alfa Aesar	10149849
Taurine	Alfa Aesar	J5407a
EGTA	Sigma	SLBM6826V
Collagenase A	Roche	10103586001
Collagenase Type II	Worthington	45k16005
BSA	Roche	735094
caffeine	Sigma	C0750
Fura-2 AM	Invitrogen	F1201
Microscope	Olympus	Olympus IX 71
Langendorff system	Beijing Syutime Technology Co	PlexiThermo-S-LANGC
Micromanipulator	Marchauser	MM33 links
Perfusion chamber	IonOptix	FHD
Valve Controlled Gravity Perfusion System	ALA	VC 3-8
valve commander software	ALA	VC 3 1.0.1.2
Precision flow regulator	Delta Med	3204315
Multi-Barrel Manifold Perfusion Pencil	AutoMate Scientific	04-08-[360]
Micron Removable Tip	AutoMate Scientific	360um i.d.
Fluorescence Measurement and Cell Dimensioning Systems	IonOptix	Hyperswitch
Recording software	IonOptix	IonWizard 6.2.59
Stimulator	IonOptix	MyoPacer EP
Sprague-dawley rats	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co.	SCXK 2016-01-007436