Evaluación del retiro de reserva e intracelular calcio diastólico calcio de retículo sarcoplásmico en cardiomiocitos ventriculares aisladas

Summary

Calcio intracelular reciclaje desempeña un papel crítico en la regulación de la función sistólica y diastólica en los cardiomiocitos. Aquí, describimos un protocolo para evaluar el Ca^{2 +} reserva de retículo sarcoplásmico y función para eliminar calcio diastólico en los cardiomiocitos por un sistema de imagen de calcio.

Abstract

Calcio intracelular reciclaje desempeña un papel crítico en la regulación de la función sistólica y diastólica en los cardiomiocitos. Cardiaco retículo sarcoplásmico (SR) sirve como un depósito de Ca^{2 +} para la contracción, que reuptakes intracelular Ca^{2 +} durante la relajación. El SR Ca^{2 +} reserva disponible para golpes es determinada para contractibility cardiaca, y la eliminación de Ca intracelular^{2 +} es crítica para la función diastólica cardíaca. Bajo ciertas condiciones fisiopatológicas, como la diabetes y la insuficiencia cardíaca, remoción de calcio deteriorada y SR Ca^{2 +} tienda en cardiomiocitos pueden implicar en el progreso de la disfunción cardiaca. Aquí, describimos un protocolo para evaluar SRCa^{2 +} reserva y diastólica Ca^{2 +} extracción. Brevemente, un cardiomiocito solo fue enzimático aislado, y la intracelular Ca^{2 +} fluorescencia indicada con Fura-2 se registró por un sistema de proyección de imagen del calcio. Para emplear cafeína para inducir total SR Ca^{2 +} liberación, preselección de un programa de interruptor automático de la perfusión por la interconexión del sistema de estimulación y el sistema de perfusión. Entonces, la guarnición de curva exponencial mono fue utilizada para analizar las constantes de tiempo de decaimiento de calcio transitorios y pulsos de calcio inducida por la cafeína. En consecuencia, la contribución de la SR Ca^{2 +}-ATPasa (SERCA) y Na⁺-Ca^{2 +} cambiador (NCX) a quitar calcio diastólico se evaluó.

Introduction

Calcio intracelular ([Ca^{2 +}]) reciclaje desempeña un papel crítico en la regulación de la función sistólica y diastólica en cardiomiocitos¹. Como sabemos, inducida por el calcio Ca^{2 +} lanzamiento inicia la excitación-contracción de acoplamiento, que traducen la señal eléctrica a la contracción. Despolarización de la membrana activa lo sarcolemales Ca tipo L^{2 +} canales, que inducen Ca^{2 +} lanzamiento de SR en el citoplasma a través de receptores de Ryanodina (RyR2) de 2. La transitoria elevada citoplásmicas Ca^{2 +} inicia la contracción de las miofibrillas. Durante el diástole, citoplásmicas Ca^{2 +} es reuptaken en el SR con el SR Ca^{2 +}-ATPasa 2 (SERCA2) y bombeado en el cardiomiocito a través de la Na⁺-Ca^{2 +} cambiador (NCX)². Este proceso conduce a la contracción y relajación de los cardiomiocitos.

El SR cardiaco es una red intracelular de la membrana que rodea la maquinaria contráctil. Sirve como un depósito de Ca^{2 +} para la contracción, y reabsorbe Ca intracelular^{2 +} durante la relajación. El SR Ca^{2 +} reserva disponible para beats es determinada para la contractilidad cardiaca. Mientras tanto, la eliminación de Ca intracelular^{2 +} es crítica para la diástole cardiaca. Bajo ciertas condiciones fisiopatológicas, como la diabetes e insuficiencia cardíaca, alteración Ca^{2 +} despacho y deprimido SR Ca^{2 +} tienda en cardiomiocitos puede estar involucrado en el proceso de disfunción cardiaca^{2,3 ,4}.

Para medir Ca SR^{2 +} liberación y diastólica Ca^{2 +} retiro en cardiomiocitos, hay dos métodos ampliamente utilizados: la integridad de la corriente NCX basado en abrazadera del remiendo^5,6y el Ca inducida por la cafeína ^{2 +} pulso basado en Ca^{2 +} fluorescencia imagen^7,8,9. Lo anterior depende el hecho de que el Ca^{2 +} de la SR es en gran medida bombeada fuera de la célula por NCX. Sin embargo, este enfoque está limitado por sus requerimientos de equipo avanzado y experto. En el presente estudio, describimos un método conveniente para evaluar reserva de SR Ca^{2 +} y Ca^{2 +} retiro en miocitos mediante la medición de un inducido por cafeína Ca^{2 +} pulso basado en un Ca^{2 +} fluorescencia sistema de imagen. Brevemente, intracelular Ca^{2 +} fluorescencia indica Fura-2. Por la interconexión del sistema de estimulación y sistema de perfusión, presentamos un programa para la perfusión y el sistema de estimulación automáticamente. cafeína 10 mM fue empleada para inducir rápidamente la total liberación de Ca^{2 +} en el SR. Las constantes de tiempo de decaimiento exponencial (Tau) de calcio transitorios y pulsos de calcio inducida por la cafeína se obtuvieron de mono exponencial curva de ajuste, que reflejan la contribución de SERCA y NCX para diastólica Ca^{2 +} retiro en consecuencia.

Protocol

animal todos los experimentos fueron realizados según protocolos de actuación aprobados por el cuidado de Animal institucional y Comité de uso en el centro de Investigación Experimental, Academia China de ciencias médicas chinas y la Universidad de Zhejiang. 1. preparación de la solución preparar todas las soluciones como se describe en la tabla 1. 2. aislamiento de izquierda Ventricular (LV) cardiomiocitos <p class="jove…

Representative Results

Aquí ilustramos streptozotocin (STZ) – indujo ratas diabéticas (DM) y pareados por edad Sprague – Dawley (SD) las ratas por ejemplo. las ratas macho SD 8 semanas de edad (200 ± 20 g) recibieron una inyección intraperitoneal de STZ (70 mg/kg, ip) para el búfer de grupo o citrato de DM en el grupo control. Una semana después de la administración de STZ, ratas con glucosa en la sangre > 16,7 mmol/L se considera diabético. Después de 8 semanas, los miocitos del LV se aislaron enz…

Discussion

Flujo de calcio liberado de lo SR es el Ca^{2 +} fuente principal para la sístole en el corazón. A cierto punto, la amplitud del SR Ca^{2 +} contenido y el fraccionario Ca^{2 +} de la SR reflejan el SR Ca^{2 +} reserva disponible para la contracción cardiaca. Por otra parte, la Ca^{2 +} reserva de SR depende de la capacidad de la recaptación de Ca SR^{2 +} , Ca^{2 +} fuga de SR y su equilibrio a través del SR durante diástole^12,</s…

Materials

NaCl	Alfa Aesar	E31K43
MgCl2	Alfa Aesar	I02T070
KCl	Alfa Aesar	G22u018
HEPEs	Sigma	SLBM 7880V
D-Glucose	Alfa Aesar	10189341
NaOH	Alfa Aesar	10154048
KOH	Alfa Aesar	10144B17
KH2PO4	Alfa Aesar	F21S033
MgSO4	Alfa Aesar	C31U038
L-Glutamic	Alfa Aesar	10149849
Taurine	Alfa Aesar	J5407a
EGTA	Sigma	SLBM6826V
Collagenase A	Roche	10103586001
Collagenase Type II	Worthington	45k16005
BSA	Roche	735094
caffeine	Sigma	C0750
Fura-2 AM	Invitrogen	F1201
Microscope	Olympus	Olympus IX 71
Langendorff system	Beijing Syutime Technology Co	PlexiThermo-S-LANGC
Micromanipulator	Marchauser	MM33 links
Perfusion chamber	IonOptix	FHD
Valve Controlled Gravity Perfusion System	ALA	VC 3-8
valve commander software	ALA	VC 3 1.0.1.2
Precision flow regulator	Delta Med	3204315
Multi-Barrel Manifold Perfusion Pencil	AutoMate Scientific	04-08-[360]
Micron Removable Tip	AutoMate Scientific	360um i.d.
Fluorescence Measurement and Cell Dimensioning Systems	IonOptix	Hyperswitch
Recording software	IonOptix	IonWizard 6.2.59
Stimulator	IonOptix	MyoPacer EP
Sprague-dawley rats	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co.	SCXK 2016-01-007436